人造堿基與人工合成生命*

陳??非???董夢醒，2???葛??猛???劉國成 中國科學(xué)院北京基因組研究所，中國科學(xué)院基因組學(xué)與信息重點實驗室 北京 0002 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 00049

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人造堿基與人工合成生命*

陳??非1董夢醒1，2葛??猛1劉國成1
1 中國科學(xué)院北京基因組研究所，中國科學(xué)院基因組學(xué)與信息重點實驗室 北京 100101
2 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049

摘要文章就人造堿基及相關(guān)人工合成生命領(lǐng)域內(nèi)的代表性研究成果進(jìn)行了全景式綜述，著重介紹了氫鍵互補(bǔ)及疏水性兩種最為主要的人造堿基對，探討了具有里程碑意義的六核酸分子人工合成生命及其對合成生物學(xué)未來發(fā)展的影響，簡單綜述了人造堿基在DNA檢測診斷試劑盒等方面的成功應(yīng)用實例。最后對這一研究領(lǐng)域的前景和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞人造堿基，人工擴(kuò)展堿基字母，非天然堿基對，合成生物學(xué)，人工合成生命

DOI 10.16418/j.issn.1000-3045.2016.04.011

*資助項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（31270846、21472182），中科院“百人計劃”（Y3CAS81554）

修改稿收到日期：2016年3 月9日

2014年5月，Nature 雜志報道了一項合成生物學(xué)的重大突破[1]。來自美國斯克利普斯研究所（The Scripps Research Institute）的 Floyd E. Romesberg 研究小組成功構(gòu)建了包含一對人造堿基對的六核酸分子人工合成細(xì)菌，首次成功實現(xiàn)人造堿基對的體內(nèi)復(fù)制。這一里程碑式的成果標(biāo)志著人造堿基的研究工作正式從體外步入了體內(nèi)。人造堿基不僅在結(jié)構(gòu)上模擬天然堿基的特征，還從實際功能出發(fā)來進(jìn)行設(shè)計和優(yōu)化，其應(yīng)用前景之廣闊給人以無限遐想。

新堿基的引入可以豐富有限的 DNA、RNA 組成元件，利用工程菌及合成生物學(xué)技術(shù)合成自然界沒有而又不易人工合成的抗生素、疫苗及其他產(chǎn)品。如在活疫苗開發(fā)領(lǐng)域，人們可以將含有人造堿基的人工合成細(xì)菌/病毒作為活疫苗接種，一方面這可以誘發(fā)免疫反應(yīng)而產(chǎn)生疫苗作用；另一方面，因為人體內(nèi)缺乏相應(yīng)的人工堿基原料，所以該細(xì)菌/病毒不會在體內(nèi)復(fù)制。因此，相比于天然細(xì)菌/病毒疫苗，含有人造堿基的人工合成細(xì)菌/病毒疫苗可能更為安全。對于目前還處于起始階段的 DNA 計算機(jī)而言，在原有的 ATCG 的 4 字母堿基基礎(chǔ)上新增加 2 個字母，就可以使 DNA 計算機(jī)從 4 進(jìn)制升為 6 進(jìn)制，其存儲能力和運(yùn)算能力都將得到極大提升，無疑會極大地促進(jìn)此項技術(shù)的發(fā)展。

盡管上述設(shè)想距離最終實現(xiàn)還有很長的路要走，但六核酸分子人工合成細(xì)菌的成功實現(xiàn)無疑是“人工合成生命”領(lǐng)域的一次有益的嘗試；其也會對化學(xué)合成生物學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展起到極大的推動促進(jìn)作用，并可能為合成生物學(xué)開辟出一條新的、更安全的別樣健康發(fā)展之路；無疑也將對生物安全領(lǐng)域產(chǎn)生極為深遠(yuǎn)的影響。

1　人造堿基與合成生物學(xué)

人造堿基的研究發(fā)展至今已有近 30 年的歷史，它又被稱為非天然堿基對或人工擴(kuò)展堿基字母，是一種通過對堿基的改造，人工設(shè)計合成的可以行使或模擬天然核酸功能、而又具有相對獨立性的人造 DNA。它的研究屬于合成生物學(xué)的一個重要分支——化學(xué)合成生物學(xué)的研究范疇[2]。化學(xué)合成生物學(xué)（Chemical Synthetic biology）是用以設(shè)計、描述并合成自然界不存在的具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的功能生物大分子元件（如新型結(jié)構(gòu)的核酸、氨基酸、小泡結(jié)構(gòu)等）[3]。正如 Kool[2]在 2000 年美國化學(xué)會年會上闡述的那樣，化學(xué)合成生物學(xué)關(guān)注的焦點并非在基因水平，而是非天然存在的功能性有機(jī)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以化學(xué)合成生物學(xué)又可以稱為“Bottom-up Synthetic Biology”[4]。

化學(xué)合成生物大分子部件除了具有合成生物學(xué)生物部件模塊化、標(biāo)準(zhǔn)化的特性外，其較強(qiáng)的獨立性（即正交性）和可操控性是其與 Venter JC 類合成生命相比的最大優(yōu)勢所在[4,5]。由于 Venter JC 類合成生命并非從頭合成生命系統(tǒng)，其最小調(diào)節(jié)模塊是建立在基因水平上的，而在分子水平采用的仍是天然的生物大分子元件（核酸、氨基酸等），所以此類“非從頭合成生命”的生物安全問題一直為人們所擔(dān)憂[6,7]。與之相反，化學(xué)合成生物大分子元件由于在自然界中并不存在，完全獨立（正交）于天然生物實體，所以由此類生物元件所組成的“從頭合成生命系統(tǒng)（Synthesis of living systems from scratch）”可能是更“純潔的”，也是更易操控的[5,8]。它們可以有效地避免與自然界中已有的生物體之間發(fā)生遺傳信息重組、轉(zhuǎn)移之類的風(fēng)險所導(dǎo)致的污染、寄生等生物安全問題；即便它們通過非正常途徑（如實驗室泄漏）進(jìn)入自然界，也會因為缺乏相關(guān)的人工養(yǎng)料基元（如相關(guān)的人工合成堿基、氨基酸等）而迅速死亡?；诖?，歐盟生物安全觀察員 Schmidt 博士[7]將之稱為終極安全的生物學(xué)平臺。

在人造堿基近30年的研究歷史中，其研究并不僅限于人工擴(kuò)展堿基相關(guān)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，它們還被廣泛擴(kuò)展到核酸檢測診斷技術(shù)、核酸適配體技術(shù)、核酸納米材料等領(lǐng)域，下面將詳述這一領(lǐng)域的代表性研究成果，著重介紹最新的研究進(jìn)展及人工擴(kuò)展堿基字母對的成功應(yīng)用實例，并對這一研究領(lǐng)域的前景和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行展望。

2　人造堿基對的起始及?Steven?A.?Benner?的工作

Steven A.Benner 博士是國際公認(rèn)的人造堿基研究領(lǐng)域的創(chuàng)始人，他在 20 世紀(jì) 80 年代中期即開始了發(fā)展人工堿基字母對的嘗試[4,6]。在對磷酸基團(tuán)和脫氧核糖的替換失敗之后[3,4]，Benner 將注意力轉(zhuǎn)到堿基對上，他發(fā)現(xiàn)天然堿基對之間的 Watson-Crick 互補(bǔ)配對遵循以下兩大原則（圖1a）：

（1）形狀互補(bǔ)——總是在體積較大的嘌呤堿基和體積較小的嘧啶堿基之間形成形狀互補(bǔ)配對。

（2）氫鍵配對——總是通過一個堿基上的氫鍵供體與另一個堿基上的氫鍵受體相互作用形成氫鍵。

基于上述兩大原則，如果將天然堿基上的氫鍵供體和氫鍵受體基團(tuán)視作可以互換的元件，將它們進(jìn)行重新洗牌，很容易就可以設(shè)計出多對新的人工模擬堿基對（圖 1b）。此處，嘌呤和嘧啶環(huán)也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑欤ㄈ?K-X, Z- P 堿基對），這又可以極大地增加人工擴(kuò)展堿基的種類。圖 1b 僅列出 7 種人工擴(kuò)展堿基及 4 種新的獨立于（正交于）天然堿基的堿基對，其實按照形狀（大與?。┖蜌滏I互補(bǔ)（氫鍵供體和受體）原則，還可以得到更多人造堿基對[4,7,8]。設(shè)計人造堿基對后需要運(yùn)用有機(jī)化學(xué)的合成技術(shù)來創(chuàng)造出這些新物質(zhì)，并把它們裝配到 DNA分子中。觀察其作為人造堿基的行為，主要是體外復(fù)制和轉(zhuǎn)錄特性。經(jīng)過 20 多年的發(fā)展，目前，人工擴(kuò)展 DNA 的生物學(xué)性能表征實驗主要應(yīng)包括：含有人造堿基對雙鏈DNA 的熔點檢測、單側(cè)引物延伸實驗、六核酸分子 PCR等；以上實驗的另一重要目的是檢驗設(shè)計合成人造堿基對的正交性（相對獨立性）（圖 2）[9-11]。更進(jìn)一步的驗證實驗還包括人造堿基對的體外轉(zhuǎn)錄及翻譯（圖 3）[12-14]。

圖 1 Benner 創(chuàng)造的人造堿基對[4, 7, 8]

圖 2 人造堿基的體外生物學(xué)性能及正交性檢驗實驗（以Z-P堿基對反應(yīng)體系為例）

圖3 人工堿基字母的體外轉(zhuǎn)錄及翻譯的實現(xiàn)[12-14]。含X:Y人造DNA堿基對的雙鏈DNA，在RNA聚合酶的作用下，經(jīng)轉(zhuǎn)錄在RNA相對應(yīng)位置插入人造RNA堿基rX。此種RNA經(jīng)翻譯后合成含有非天然人工合成氨基酸的蛋白質(zhì)

運(yùn)用上述人造堿基對設(shè)計原則及生物學(xué)性能表征手段，1989 年，Benner 研究組[12]首先成功實現(xiàn)了包含人造堿基對 isoG-isoC 的 DNA 的體外復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。1990 年，他們又實現(xiàn)了包含另一對人造堿基對 K-X 的 DNA 的體外復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[13]。隨后在 1992 年，利用 isoG-isoC 互補(bǔ)配對，借助人工合成含有反密碼子 CU（isoG）的 tRNA 的幫助，Benner 研究組進(jìn)一步通過體外翻譯系統(tǒng)將含有 isoC 的人工擴(kuò)展密碼子（isoC）AG 翻譯成一個非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 3-碘化酪氨酸并成功的摻入到一段小肽中[14]。

通過單側(cè)引物延伸實驗，對以上兩種人造堿基對的體外復(fù)制保真性進(jìn)行檢驗時，其結(jié)果并不十分理想。從20 世紀(jì) 80 年代末開始，Benner 研究組始終致力于尋找性能更優(yōu)異的人造擴(kuò)展堿基。2006 年，Benner 研究組終于發(fā)現(xiàn)了一對比較優(yōu)秀的人造堿基對 Z-P[9]。筆者非常有幸在 2005 年加入了 Benner 的研究小組，并作為主要參加人員參與了 Z-P 堿基對的大部分研發(fā)工作。

Z 和 P 采用 pyDAA-puADD 氫鍵配對方式（圖 1）能夠使 Z-P 堿基對綁定的更加緊密，形成氫鍵的穩(wěn)定性要比 C:G 更強(qiáng)[9]。更為重要的是，基于 Watson-Crick 互補(bǔ)配對原則設(shè)計的 Z-P 堿基對更容易被 DNA 聚合酶所識別[15]（圖 4）。單側(cè)引物延伸及 PCR 實驗也證明了這一點，絕大多數(shù)商業(yè)化的 DNA 聚合酶都能識別 Z-P 堿基對，且保真性可高達(dá) 99.8%[10,16]。2006年至今，關(guān)于 Z-P 人造堿基對共有多篇文章發(fā)表在 PNAS, JACS, Angew Chem., Nucleic Acid Res. 等國際著名生物和化學(xué)領(lǐng)域的頂級期刊上，其應(yīng)用被廣泛地擴(kuò)展到六核酸分子適配體、多重巢式 PCR 反應(yīng)、luminex 核酸檢測、分子信標(biāo)檢測等研究領(lǐng)域[16-20]。

圖4 C-G, Z-P, isoC-isoG堿基上小溝上的非共享電子對（紅圈表示）：C-G, Z-P 堿基對各有兩對非共享電子對，容易被天然DNA聚合酶所接受；isoC-isoG只有一對非共享電子對，所以不容易被天然DNA聚合酶所接受[15]

3　疏水性人造堿基對

1997—1998年，斯坦福大學(xué)的 Kool ET 創(chuàng)造出來一種疏水性人造堿基對（Z-F）[21-23]。他認(rèn)為氫鍵配對并非人造堿基對設(shè)計所必須，相對而言化學(xué)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)、堿基的堆積和靜電排斥作用更為重要。他的研究小組正是利用這一設(shè)想，成功地創(chuàng)造了第一對疏水性人造堿基對 Z-F（T: A 堿基對的類似物）（圖 5a）。不過 Z-F 配對的保真性并不好，而 A: F 以及 Z:T 之間的配對卻更為高效[24]。隨后，Kool ET 研究組[4]又報道了另一對可被 Klenow DNA 聚合酶識別的 P: Φ 疏水性人造堿基對（圖 5a）。Kool ET 研究組的工作揭示了發(fā)展疏水性人工合成堿基對的可能性，從而吸引了包括 Hirao I 以及Romesberg FE 在內(nèi)的一批合成生物學(xué)家開始進(jìn)行疏水性人造堿基對的研究。

2006年，Hirao 等人[25]開發(fā)出了一對新的疏水性人工堿基對 Ds 和 Pa（圖 5b）。然而，很快他們就發(fā)現(xiàn)疏水性人造堿基普遍存在自身配對的問題。偶然地，一次實驗上的疏忽讓 Hirao 等人在合成 dDsTP 時意外合成了一種衍生物 γ-氨基 dDsTP（dDsTPNH2）。出于好奇，他們使用這一衍生物代替 dDsTP 進(jìn)行了單側(cè)引物延伸實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這種情況下，Ds 只會摻入到與模板鏈上Pa 相對應(yīng)的位置而不再摻入到與 Ds 相對應(yīng)的位置?；谏鲜鼋Y(jié)果，2006 年該研究組報道了包含 Ds-Pa 的人工擴(kuò)展 DNA 的高效 PCR 擴(kuò)增，和包含這一堿基對及其衍生物（主要是包含各種修飾的 Pa）的人工擴(kuò)展 DNA 的體外轉(zhuǎn)錄[25]。這一工作第一次真正實現(xiàn)了包含一對非天然堿基對的人工擴(kuò)展 DNA 的高效體外復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[26]。

2009年，Romesberg 團(tuán)隊[7]從他們此前開發(fā)出的 60 種疏水性人工堿基中，篩選出一對在體外可以高效復(fù)制的疏水性堿基對 dMMO2-dSICS（圖 5c）。然而他們遇到了和 Hirao 研究組開發(fā) Ds-Pa 時所遇到的類似難題，即 dSICS 的自我配對問題。所不同的是，他們通過在 dSICS 的 5 位引入一個甲基，成功地克服了這一難題，創(chuàng)造出了新的人造堿基對 dMMO2-d5SICS（圖 5c）[26]。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊進(jìn)一步發(fā)展出了人造堿基對 dNaM-d5SICS（圖 5c）[8]。同年，Romesberg 研究組報道了包含這兩對疏水人工堿基對的 PCR 擴(kuò)增以及體外轉(zhuǎn)錄[9,10]。他們在對含有單個 dNaM-d5SICS 堿基對的模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，還實現(xiàn)了含有兩個連續(xù)或者不連續(xù)的 dNaM-d5SICS 堿基對的模板的高保真性 PCR 擴(kuò)增（99.5%—99.6% 每個循環(huán)）[11]。最近，通過對 d5SICS 堿基的進(jìn)一步改造，該團(tuán)隊發(fā)展出了一對更為優(yōu)異的非天然堿基對 dNaM-dTPT3（圖 5c）[12]。使用 OneTaq 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時，dNaM-dTPT3 復(fù)制的保真性超過了99.98% 每個循環(huán)，這在某種程度上已經(jīng)與天然堿基的復(fù)制保真性（10-4—10-7的錯誤率）相當(dāng)接近了[8]。

圖5 一些代表性的疏水性人造堿基對

4　含有人工堿基對的六核酸分子合成生命系統(tǒng)的誕生

至 2012 年前后，至少已經(jīng)有包括 Benner、Hirao、Romesberg 3 個研究團(tuán)隊獨立開發(fā)出了數(shù)對各方面性能都接近于天然堿基對的人造堿基對。這些工作為非天然堿基對的研究工作從體外走向體內(nèi)，使用人造堿基對創(chuàng)造半合成生命奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2014年，Romesberg 團(tuán)隊首先在這一領(lǐng)域獲得了突破性的進(jìn)展，他們在實現(xiàn)了 dNaM-d5SICS 的人造堿基對的高效高保真體外 PCR 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄之后，隨即啟動了將這一人工堿基對應(yīng)用于大腸桿菌體內(nèi)的研究計劃。盡管在體外表現(xiàn)優(yōu)異，但要將其成功的應(yīng)用到生物體內(nèi)顯然還必須面對更多的挑戰(zhàn)。首先，dNaM 和 d5SICS 完全是由人工創(chuàng)造出來的非天然堿基，因而 Romesberg 團(tuán)隊面臨的第一個難題是如何保證細(xì)胞內(nèi)有足夠的 dNaMTP 以及 d5SICSTP 單體以用于這種人工 DNA 的復(fù)制。為了解決這一問題，Romesberg FE 研究組嘗試了一系列不同來源的核苷三磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，最終發(fā)現(xiàn)一種海藻葉綠體的核苷三磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 PtNTT2 能夠高效地將添加在培養(yǎng)基中的 dNaMTP 和 d5SICSTP 單體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[1]。隨后，通過向培養(yǎng)基中添加磷酸鉀，該團(tuán)隊又有效緩解了這兩種人工合成核苷三磷酸在培養(yǎng)基以及細(xì)胞內(nèi)容易降解的問題[1]。

此后，該團(tuán)隊構(gòu)建了一個含有一對人工堿基對的質(zhì)粒 pINF，并且系統(tǒng)地研究了這個質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制情況[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在開啟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 PtNTT2 表達(dá)以及培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的外源人工核苷三磷酸的情況下，這一半合成質(zhì)粒能夠以適當(dāng)?shù)乃俣群蜏?zhǔn)確度進(jìn)行復(fù)制，并且?guī)缀醪蛔璧K大腸桿菌細(xì)胞生長，也沒有明顯表現(xiàn)出其他失去非天然堿基對的跡象[1]。研究結(jié)果顯示，這一半合成質(zhì)粒中的非天然堿基對的復(fù)制保真性超過了 99.4%，這一保真性與某些病毒的 DNA 聚合酶相當(dāng)。新堿基至少復(fù)制了 24 輪，并維持了近一周時間。當(dāng)沒有這一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)或是沒有新堿基提供時，非天然堿基d5SICS 和 dNaM 將會逐漸被天然堿基 A、T、C、G 所替換，并最終從基因組中完全消失。而這種堿基替換已被證明源于 DNA 復(fù)制中的堿基錯配而不是細(xì)胞內(nèi)的 DNA 修復(fù)系統(tǒng)（圖 6）[1]。

2014年5月7日，Romesberg 領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊在Nature 上在線優(yōu)先發(fā)表論文，宣告了包含一對人造堿基對（dNaM-d5SICS）的六核酸分子半合成大腸桿菌的誕生。同期 Nature 為這一工作配發(fā)了評論[17]，5月9日出版的 Science 也對這一工作作出了評論[19]。這一工作可以說是迄今為止人造堿基研究領(lǐng)域最為重要的“里程碑”之一，從而標(biāo)志著有關(guān)人造堿基對的研究工作正式從體外步入了體內(nèi)。Romesberg 的成功激發(fā)了人們的無限遐想：有沒有可能添加更多的堿基呢？能不能用這些新零件創(chuàng)造出更復(fù)雜的生物呢？正如羅斯·泰爾在 Nature 的評論中所闡述的，“他們揭示了遺傳學(xué)的一種新機(jī)制，使得誕生更加豐富的生物形態(tài)成為可能，并有可能創(chuàng)造更加美好的生物學(xué)未來”。 Romesberg 甚至想得更遠(yuǎn)，他認(rèn)為雖然此次研究中的人工堿基對還不能參與制造新型蛋白質(zhì)，但從理論上說，新增加兩個字母， DNA 就有望從 4 進(jìn)制升格為 6 進(jìn)制，6 種堿基意味著更多的排列組合，更龐大的氨基酸編碼庫，即可將構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸從目前的 20 種提升至 172 種。

圖 6 非天然堿基對模擬天然堿基對在生物體內(nèi)發(fā)生作用的示意圖[1]。綠色表示在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的核苷三磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 PtNTT2，其能夠?qū)⑻砑釉谂囵B(yǎng)基中的dNaMTP 和 d5SICSTP 單體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中；紅色表示 dNaM : d5SICS 堿基對；XAA 和 YTT 分別表示對應(yīng)的 tRNA 上的反密碼子和 mRNA 上的密碼子，其中 X 和 Y 代表非天然堿基，A 和T 代表天然堿基

5　人造堿基對在生命健康等領(lǐng)域的應(yīng)用

人造堿基對的應(yīng)用不僅僅限于從頭合成生命，其應(yīng)用還被擴(kuò)展到了核酸檢測診斷技術(shù)、六分子核酸適配體技術(shù)等領(lǐng)域，其在分支 DNA 檢測（branched DNA assay）診斷試劑盒中的應(yīng)用是一個的典型范例。此診斷試劑盒目前已在多個國家上市，被廣泛應(yīng)用于對 HIV、HPV 和 HCV 的臨床檢測診斷，僅在美國，每年就有 400 000 人應(yīng)用這一診斷試劑盒，年產(chǎn)值超過 1 億美元。

分支 DNA 檢測技術(shù)產(chǎn)生得很早，依據(jù)核酸雜交原理對目標(biāo)基因 DNA 或 RNA 進(jìn)行檢測。該系統(tǒng)主要由目標(biāo)檢測系統(tǒng)（包括 Target probe 和 capture probe 等）、branched DNA 信號放大系統(tǒng)（包括 label probe、preamplifier 和 amplifier）組成（圖 7a）[21,22]。Benner 等人成功地將第一對人造堿基對（isoG 和 isoC）應(yīng)用此技術(shù)（又被稱為三代 branched DNA 檢測技術(shù)），他們向上述各種探針中摻入大約 30% 的非天然堿基 isoC 和 isoG，改善了由于多種不同的探針在同一體系中使用所產(chǎn)生的背景噪音信號從而使檢測靈敏度從 100 000 個 HIV 分子/毫升升至 1 000 個HIV 分子/毫升[20,23,27]。

人造堿基對在分子信標(biāo)（molecular beacon）核酸檢測技術(shù)中的應(yīng)用也被廣泛嘗試。2008 年，Benner 研究組報道了一種新型的分子信標(biāo)（圖 7b）[28]。在這種分子信標(biāo)中，非天然堿基對 Z-P 被引入到分子信標(biāo)的莖部。由于 Z-P 堿基對與天然堿基對之間存在正交性，使得各種非特異性結(jié)合明顯減少，從而顯著地提高了分子信標(biāo)的檢測靈敏度[28]。2010 年 Benner 研究組還將 Z-P 堿基對引入到反向巢式 PCR 的引物中，同樣取得了非常理想地提高靈敏度的效果（圖 7c）[29]。

科學(xué)家們也嘗試將人工擴(kuò)展堿基應(yīng)用于核酸適配體（aptamer）研究領(lǐng)域。2013 年，Hirao 研究組首次將非天然堿基引入到了 aptamer 篩選中（圖 7d）[30]。2014 年，Benner 研究組首次將完全隨機(jī)的人工擴(kuò)展DNA 文庫成功用于 aptamer 篩選（圖 7e）[31]。結(jié)果證明，相對于傳統(tǒng) aptamer 動輒 15—20 輪次的篩選工作量而言，采用人工擴(kuò)展 DNA 文庫進(jìn)行篩選的輪次和工作量大大降低，篩選得到的 aptamer 性能也更好[30,31]。

對于人造堿基的應(yīng)用研究，除了上述提到的基于正交性和多樣性所產(chǎn)生的各種應(yīng)用之外，科學(xué)家的一些偶然發(fā)現(xiàn)也促成了一些新的應(yīng)用。比如 Hirao 研究組在優(yōu)化各種非天然堿基對時，發(fā)現(xiàn)一種 Ds 堿基的衍生物 Dss 可以發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，這種堿基同樣可以與 Pn 或者 Px 形成穩(wěn)定配對，更為重要的是，一旦配對形成，Dss 堿基所發(fā)出的熒光會被完全淬滅[32]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，Hirao I 研究組成功開發(fā)了利用這一新型堿基對作為熒光和淬滅基團(tuán)的分子信標(biāo)（圖 7f），并將這一堿基對成功地用在了實時定量 PCR 中（圖 7g）[32]。

6　總結(jié)和展望

除了人工改造堿基之外，科學(xué)家們也一直在進(jìn)行氨基酸的人工改造。以斯克利普斯研究所 Peter Schultz 為代表的一些合成生物學(xué)家已實現(xiàn)了向蛋白質(zhì)中定點摻入各種非天然氨基酸以實現(xiàn)各種功能，不過他們是利用天然堿基的無義密碼子 TAG 來進(jìn)行編碼的，因而一次只能摻入一種非天然氨基酸。要想同時向蛋白質(zhì)中摻入多種不同的非天然氨基酸，必然需要對現(xiàn)有的遺傳信息系統(tǒng)進(jìn)行人工擴(kuò)展。從 Benner[2]率先提出并開展有關(guān)人造堿基對的研究工作以來，已經(jīng)過去了 20 多年，一系列性能優(yōu)越的人造堿基對被不同的研究團(tuán)隊創(chuàng)造出來。2014 年含有非天然堿基對的半合成生命的誕生更是標(biāo)志著這一領(lǐng)域的研究正式從體外走向了體內(nèi)[1,17,19]。然而要想真正實現(xiàn)在生物體內(nèi)使用人造堿基對，利用人工擴(kuò)展密碼子編碼各種非天然氨基酸，從而按需定制各種非天然功能蛋白質(zhì)的長遠(yuǎn)目標(biāo)，這一領(lǐng)域還有很長的路要走。

首先，需要設(shè)計并創(chuàng)造性能更為優(yōu)越的人造堿基對。必須承認(rèn)即便是現(xiàn)在最為成功的人造堿基對的復(fù)制保真性較天然堿基對而言也仍然存在著明顯的差距。其次，需要進(jìn)一步優(yōu)化與轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)的各種酶及工作元件。盡管在 20 多年前，Bernner 研究組就已經(jīng)利用早期人造堿基對 isoC-isoG 在體外實現(xiàn)了從復(fù)制到轉(zhuǎn)錄、再到翻譯的中心法則整個流程。但在那之后，相對于復(fù)制，有關(guān)人造堿基對的轉(zhuǎn)錄尤其是翻譯的研究工作就大大滯后了。

總而言之，Romesberg 的成功使得合成生物學(xué)家們的目標(biāo)更加明晰——就是在生物體內(nèi)擴(kuò)展遺傳密碼，提高遺傳密碼的多樣性，進(jìn)而可以根據(jù)需要定制出各種含有人工擴(kuò)展堿基的功能 DNA、RNA 及含有各種非天然氨基酸的功能蛋白質(zhì)的新型生命形式。當(dāng)然，這項技術(shù)和任何技術(shù)一樣（如基因工程、核物理等），既可以造福人類，也可以毀滅人類（生物武器、核武器）。技術(shù)本身并沒有問題，關(guān)鍵是看應(yīng)用技術(shù)的人的動機(jī)。希望在未來科學(xué)家可以創(chuàng)造出更多形式和功能的可控新型生命，造福全人類。

圖 7 一些人工擴(kuò)展堿基的應(yīng)用實例

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陳??非 中科院北京基因組所研究員，博士生導(dǎo)師，中科院“百人計劃”引進(jìn)人才。在美期間曾師從“合成生物學(xué)”聯(lián)合創(chuàng)始人 Steven A. Benner。目前主要致力于致病微生物基因組學(xué)及宏基因組學(xué)研究，有多篇研究論文發(fā)表在 PNAS、JACS、Nucleic Acid Res 等國際頂級期刊上。E-mail: chenfei@big.ac.cn

Chen Fei Professor in “100 Talents Program” of Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences. From 2005 to 2012, he worked in Benner SA’s group, one of the pioneer groups in the emerging field of “Artificially DNA bases”. Currently, his research interest is mainly focused on pathogen genomics, as well as metagenomics. He has published number of peer-reviewed papers in scientific journals including PNAS, JACS, and Nucleic Acid Res.. E-mail: chenfei@big.ac.cn

Artificial Base and Synthetic Life

Chen Fei1Dong Mengxing1,2Ge Meng1Liu Guocheng1
（1 CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Abstract“Artificial Base” is also known as “Expanded Genetic Alphabets”. Through modifying normal bases, it is designed to achieve the function of native nucleic acid, which was first introduced about thirty years ago. In 2014, Nature reported a semi-synthetic Escherichia coli, whose genome contains a pair of unnatural base pair which can be stably propagated in the semi-synthetic bacterium. This landmark work was selected as one of the top ten breakthroughs of 2014 by the Science journal. Here, we panoramically review the representative achievements in the field of artificial base and synthetic life, particularly two leading artificial base pairs respectively with alternative hydrogen bonding pattern and hydrophobic shape complementation pattern. Moreover, we discuss the significant work regarding the synthetic living system with sixletter nucleotides and its effect on future developments of synthetic biology. The successful applications of diagnostic kit for DNA test and other cases are also introduced. Finally, we discuss the further work required to this field and the challenges.

Keywordsartificial base， expanded genetic alphabets, unnatural base pair, synthetic biology, synthetic life