脊髓損傷后星型膠質細胞活化與線粒體融合蛋白2表達變化

李長麗,鄭　莉，蔣　猛，易成臘，白祥軍

430015 湖北 武漢，湖北省中西醫結合醫院老年病科(李長麗，鄭莉)； 430030 湖北 武漢，華中科技大學同濟醫學院

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·論著·

脊髓損傷后星型膠質細胞活化與線粒體融合蛋白2表達變化

李長麗,鄭莉，蔣猛，易成臘，白祥軍

430015 湖北 武漢，湖北省中西醫結合醫院老年病科(李長麗，鄭莉)； 430030 湖北 武漢，華中科技大學同濟醫學院

【摘要】目的探索脊髓損傷后星型膠質細胞(AS)活化與線粒體融合蛋白2(Mfn2)的表達規律及其意義，為脊髓損傷修復尋求合適的干預靶點及時機。方法建立成年SD大鼠脊髓損傷(SCI)模型，運用免疫熒光和Western Blotting方法，檢測Mfn2及AS活化相關蛋白膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達變化。清潔級成年雄性SD大鼠48只，隨機分為兩組：假手術組(sham組，n=24)，脊髓損傷組(SCI組，n=24)，SCI組采用Allen’s法建立大鼠胸段脊髓損傷模型，sham組只行椎板切除術，分別于術后第1天、第3天、第7天、第14天4個時間點分批處死大鼠，取大鼠胸段脊髓組織，行組織免疫熒光染色觀察脊髓形態變化，Western Blotting檢測各個時間點Mfn2與GFAP的表達變化。結果脊髓損傷后，大鼠胸段脊髓灰質兩背角之間會形成結構紊亂、邊界不清的損傷灶；Western Blotting及免疫熒光結果顯示脊髓損傷后，大鼠胸段脊髓Mfn2蛋白表達從第1天開始下降，與sham組相比，脊髓損傷組胸段脊髓Mfn2表達整體呈下降趨勢，術后第3天開始明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；而GFAP表達隨時間延長則逐漸增加，術后第3天開始差異有統計學意義(P<0.05)。結論脊髓損傷后，AS的特異性標志物GFAP表達整體呈上升趨勢，提示此時AS出現大量增殖；與此相反，Mfn2(增殖抑制基因)表達產物則明顯減少。

【關鍵詞】脊髓損傷； 線粒體； 膠質細胞； 蛋白； 大鼠

影響脊髓損傷后神經功能恢復和軸突再生的因素主要包括兩方面：損傷脊髓周圍存在不利細胞生存的內環境及哺乳動物成熟神經元內在再生能力的減弱，其中膠質瘢痕形成及其含有的多種抑制因子是影響軸突再生的重要外部因素。眾多的實驗研究表明，星形膠質細胞活化是形成膠質瘢痕的重要因素[1-2]。

線粒體融合蛋白(mitofusions,Mfn) 參與線粒體膜融合過程，在維持線粒體形態和功能中起重要作用。Mfn在哺乳動物中編碼Mfn1和Mfn2兩種蛋白質分子,Mfn2又名增殖抑制基因(hyperplasia suppressorgene,HSG),是我國學者陳光慧利用差異顯示技術發現的一個新基因[3],其功能除介導線粒體融合外，還參與了細胞的能量代謝、信號轉導、增殖及凋亡等眾多細胞生物學過程。據文獻報道，Mfn2能夠通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK1/2信號通路的激活，增加周期素依賴性蛋白激酶抑制物(CKls)P27、P21的表達，從而使血管平滑肌細胞停留在G0/G1期。而脊髓損傷修復過程亦涉及膠質細胞異常增殖，并且Mfn2在星形膠質細胞內有較高的表達，筆者推測其功能狀態或許與脊髓損傷后星形膠質細胞活化密切相關。因此本實驗擬通過大鼠的脊髓損傷模型探索Mfn2在脊髓損傷后的表達變化，觀察其與星形膠質細胞活化的相關性，以期為脊髓損傷修復治療提供新的視角。

材料與方法

1實驗動物及其分組

清潔級成年雄性SD大鼠48只，體重250～350g，均購自華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，分籠喂養，自由飲食水，并且保持自然晝夜節律。動物模型制備前禁食水12h。實驗動物隨機分為假手術組(sham組，n=24)，脊髓損傷組(SCI組，n=24)。動物實驗經華中科技大學實驗動物倫理委員會批準。

2動物模型的建立和時間點設定

脊髓損傷組采用改良的Allen’s法建立脊髓損傷模型[4]，使用10%水合氯醛，以4mL/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉滿意后大鼠俯臥位固定，對背部擬行切口處皮膚剪毛、消毒、鋪巾，作4cm長的縱行皮膚切口，分離各層皮下組織暴露T10椎體，咬除棘突及椎板暴露T10脊髓。以后正中血管為中心，將重10g的金屬棒從40mm高處垂直自由下落撞擊硬脊膜，造成T10段脊髓沖擊損傷，損傷直徑約為3mm，局部采用無菌棉球止血，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。損傷模型成功的標志是：金屬棒撞擊脊髓時，大鼠身體抖動，雙下肢迅速回縮并彈起撲動，尾巴翹起并迅速倒下。sham組只做椎板切除，不行脊髓損傷打擊。所有大鼠術后均應用抗生素，以每只3萬U/次，2次/d的劑量腹腔注射青霉素(由同濟醫院藥劑科提供)，連續3d。術后軟食喂養，定時行擠壓排尿。分別在術后4個時間點，即第1、3、7、14天取大鼠胸段脊髓組織。

3取材及冰凍切片制備

各時間點將大鼠麻醉后暴露心臟，經左心室快速灌注生理鹽水約300mL直至流出澄清液，然后使用4%多聚甲醛灌注固定約1h后，取以損傷為中心長約5mm的胸段脊髓組織，置于4%多聚甲醛液體中后固定4℃過夜，30%蔗糖溶液中脫水48h。冰凍切片包埋膠(OCT膠)包埋，冰凍切片機切片，切片厚度20μm，所切標本放入-20℃冰箱保存備用，用于免疫熒光染色。

4組織免疫熒光染色

從-20℃冰箱取出片子→置入電熱恒溫鼓風干燥箱晾干→將脊髓標本所在位置用組化筆圈起來→磷酸緩沖鹽(PBS)溶液水平搖床上5min/次清洗3次→破膜;0.3%Triton 液室溫破膜15min→PBS溶液水平搖床上5min/次清洗2次→封閉；正常山羊血清封閉液室溫下封閉40min→孵育一抗；按1∶200稀釋Mfn2一抗后4℃冰箱孵育過夜→洗掉一抗；浸泡在PBS溶液缸中搖床上8min/次，清洗3次→孵育二抗；按1∶100稀釋熒光二抗后室溫避光孵育2h→洗掉二抗;浸泡在PBS溶液缸中搖床上8min/次清洗3次→甘油封片→正置熒光顯微鏡下觀察結果。

5蛋白提取

(1)各個時間點，麻醉大鼠后迅速處死，置于冰上快速切取以損傷節段為中心約1cm長胸段脊髓組織，放于EP管并立刻置入-80℃深低溫冰箱保存備用； (2)待所有時間點脊髓標本收集完整后，從-80℃冰箱取出放置于冰上，并將苯甲基磺酰氟(PMSF)加入到放射免疫分析(RIPA)裂解液中，使裂解液中PMSF濃度為1mM； (3)按每20mg組織加入200μL裂解液的比例加入適量含PMSF的RIPA裂解液，在冰上使用玻璃勻漿器充分勻漿； (4)4℃離心機，12 000g離心15min取上清即為提取的蛋白溶液，用牛血清蛋白(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度； (5)加入適量5×上樣緩沖液，使上樣緩沖液最終濃度為1×，煮沸蛋白10min使蛋白變性，放入-20℃冰箱備用。

6Western Blotting檢測

(1)將長短玻璃板洗凈晾干，正確置于制膠架上； (2)灌膠：玻璃板對齊垂直固定于架子上，按前述配方配置10%的濃縮膠進行灌膠，至約2/3位置，然后上層加水封膠壓平，室溫約20min后在膠和水之間出現一條水平折線，說明分離膠已凝固；倒掉上層水并用濾紙吸凈玻璃板間殘留水滴，配置濃縮膠并填滿玻璃板之間的剩余空間，水平插入10孔梳子； (3)加樣：用微量加樣器加樣，根據測得的樣本蛋白濃度，每孔加入100μg蛋白樣品；(4)電泳：濃縮膠中穩流0mA，分離膠中穩壓80U； (5)轉膜：200mA穩流進行，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的轉膜時間為50min左右，神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的轉膜時間為80min左右，Mfn2的轉膜時間為140min左右； (6)封閉：10%牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫搖床上封閉1h； (7)孵一抗：用5%的BSA稀釋一抗，其中Mfn2按1∶1000、GFAP按1∶1000、GAPDH按1∶3000的濃度稀釋，4℃過夜； (8)孵二抗：1×混合配方緩沖鹽(TBST)溶液以10min/次洗膜3次后，二抗按1∶3000濃度稀釋，室溫下孵育2h； (9)洗二抗：1×TBST溶液以8min/次洗3 次； (10)電化學發光(ECL)顯色液試劑盒中A液和B液按1∶1混合配備，將配好的顯色液滴在膜上5min 后，在Western Blotting曝光儀中觀察實驗結果。

7細胞免疫熒光染色

培養皿中的貼壁星形膠質細胞棄培養基，用PBS溶液清洗3次(5min/次)→冰甲醇室溫固定15min后，PBS溶液清洗2次(8min/次)→封閉;山羊血清封閉液室溫下封閉1h→孵育一抗，4℃過夜;Mfn2抗體按1∶200稀釋；GFAP抗體按照1∶100稀釋→PBS溶液水平搖床8min/次清洗3次→孵育二抗;滴加1∶100稀釋的二抗后室溫避光孵育2h；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗兔二抗1∶100；Cy3標記的山羊抗小鼠二抗1∶100→PBS清洗3次(8min/次)→甘油封片，正置熒光顯微鏡下觀察結果。

8統計學處理

結果

1胸段脊髓組織免疫熒光檢測

病理切片免疫熒光檢測結果顯示，sham組脊髓組織結構清晰，灰、白質邊界清楚，對比明顯，無明顯空腔和出血。SCI組可見灰質結構破壞，特別是兩背角之間可見大面積損傷灶，內部存在空洞，結構難辨別，邊界不清晰，染色程度不一，甚至形成囊腔及膠質瘢痕(圖1)。

2胸段脊髓組織中Mfn2表達變化

Western Blotting結果顯示，與sham組相比，SCI組Mfn2的表達隨時間延長逐漸降低；條帶灰度值掃描結果顯示，脊髓損傷后Mfn2表達隨時間推移整體呈下降趨勢，從第3天開始出現明顯下降，并且差異有統計學意義(P<0.05，圖2a)。免疫熒光檢測顯示，隨著脊髓損傷時間的推移，Mfn2的表達逐漸降低(圖2b)。

3GFAP表達變化

Western Blotting結果顯示，與sham組相比，SCI組GFAP的表達變化隨時間延長逐漸增加；條帶灰度值掃描結果顯示，脊髓損傷后GFAP表達隨時間推移整體呈上升趨勢，從第3天開始GFAP的表達明顯增加，并且差異有統計學意義(P<0.05，圖3a)。免疫熒光結果也觀察到一致的結果(圖3b)。

圖1sham組與SCI組第7天脊髓組織免疫熒光(厚度20μm40×)

ab

圖2a.不同時間點MFn2表達(Western Blotting)； b.不同時間點MFn2表達(免疫熒光)

ab

圖3a.不同時間點GFAP表達(Western Blotting)； b.不同時間點GFAP表達(免疫熒光)

討論

脊髓損傷后損傷部位AS細胞通過自分泌、旁分泌的細胞因子促進自身分裂增殖，形成膠質瘢痕，活化的星型膠質細胞(AS)是形成膠質瘢痕的最主要細胞成分。膠質瘢痕的形成是一把雙刃劍，在SCI早期可隔離損傷刺激、調節炎癥反應、維持局部內環境穩定，起保護性屏障作用，但是發展到脊髓損傷的晚期，AS大量增殖伴胞體肥大，導致細胞大量重疊，不但成為阻止軸突生長的物理屏障，而且其還分泌抑制軸突生長的化學成分。

脊髓損傷后晚期由于AS大量活化形成的膠質瘢痕是阻礙脊髓損傷修復的重要物理及生化屏障，因此尋找能夠有效抑制AS過度活化和膠質瘢痕形成的手段，對促進脊髓損傷后軸突再生、最終達到脊髓損傷修復的目的至關重要。而對AS活化進行細胞周期調控是近來研究神經損傷修復的一個新的方向，已有研究表明白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和睫狀神經營養因子(ciliary neurotropic factor,CNTF)可以刺激AS由靜止態轉為活化態，成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factors-2，FGF-2)、上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能夠刺激活化的AS進入細胞周期[5]。Di-Giovanni等[6]在運用一種能對小分子細胞周期素依賴性蛋白激酶起抑制作用的抑制劑Flavopiridol后，膠質瘢痕的形成減少，且對正常生理狀態下的AS細胞并無抑制作用。由此表明細胞周期的重新啟動在AS的活化增殖過程中扮演著重要角色，倘若能夠尋求有效地抑制AS細胞周期重啟的手段，必定將能夠為脊髓損傷修復提供新的治療靶點。

Mfn2其功能除介導線粒體融合、參與細胞能量代謝和信號轉導外，還能起調控細胞增殖和凋亡等眾多作用。Mfn2編碼產物可通過抑制ERK/MAPK的信號傳導途徑，使細胞周期停滯在G0/G1期，從而起抑制細胞增殖作用，已有許多研究發現Mfn2蛋白有抑制細胞過度增殖的效應。Guo等[7-9]分別在心血管、腫瘤及腎臟的研究中發現，各自研究疾病出現細胞異常增值時，內源性Mfn2表達減少，運用腺病毒載體導入外源性基因，使Mfn2表達增加后，原異常增殖的細胞增殖現象得到抑制，因此認為Mfn2過表達時能抑制細胞過度增殖。

GFAP又名膠質纖維酸性蛋白，是一種星形膠質細胞特異性蛋白質，其含量的變化可以反映星形膠質細胞數量或活化程度的改變，因此被選為本次實驗檢測指標。在離體培養的星形膠質細胞內檢測到有Mfn2蛋白表達，這為研究Mfn2蛋白與脊髓損傷后星形膠質細胞膠質瘢痕的形成之間的關系提供了理論依據。本實驗發現，脊髓損傷后星形膠質細胞的特異性標志物GFAP表達呈顯著上升趨勢，傷后第3天起與sham組相比上升幅度較大，與此相反，脊髓損傷后脊髓組織內Mfn2表達呈下降趨勢，表明在脊髓損傷后出現內源性Mfn2 表達減少。通過上述現象，筆者認為脊髓中內源性Mfn2這種增殖抑制基因表達減少可能在脊髓損傷后AS過度活化過程中扮演重要角色。本實驗證實了脊髓損傷后內源性Mfn2表達減少與星形膠質細胞過度活化之間的關系，為研究抑制膠質瘢痕形成促進脊髓損傷修復提供了新的靶點，但其具體作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Morin-Richaud C,Feldblum S,Privat A.Astrocytes and oligodendrocytes reactions after a total section of the rat spinal cord[J].Brain Res,1998,783(1):85-101.

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[9] Wan-Xin T,Tian-Lei C,Ben W,et al.Effect of mitofusin 2 overexpression on the proliferation and apoptosis of high-glucose-induced rat glomerular mesangial cells[J].J Nephrol,2012,25(6):1023-1030.

(本文編輯： 黃小英)

The relationship between expression changes of Mfn2 and astrocyte activation after spinal cord injury

LIChang-li1,ZHENGLi1,JIANGMeng2,YICheng-la2,BAIXiang-jun2

(1.Department of Geriatrics,Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese & Western Medicine,Wuhan430015;2.Department of Traumatic Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between expression changes of Mfn2 and astrocyte activation after spinal cord injury(SCI) and analyze its significance,so as to provide a basis for the next research about overexpression of Mfn2 suppressing the astrocytes activation after SCI. MethodsThe rat models of SCI were built and the expression of Mfn2 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) was detected using the methods of immunofluorescence-staining and Western Blotting. Forty-eight adult male SD rats were randomly divided into two groups: sham group(n=24) and SCI group(n=24). Thoracic spinal cord injured model was built in animals of the SCI group according to the Allen’s method,but the animals of the sham group only received laminectomy. Animals were anesthetized and thoracic spinal cord tissues were taken at the days of 1,3,7 and 14 separately. Then histologic-immunofluorescence-staining was made to observe the morphology of the spinal cord and Western Blotting was made to detect the expression changes of GFAP and Mfn2 at various time points. ResultsThe immunofluorescence staining result showed that after SCI,the thoracic segment between dorsal horns of spinal cord grey matter was damaged and the structure was disordered and the boundary was not clear;the result of Western Blotting showed that after SCI,the expression of Mfn2 in the thoracic spinal cord was decreased from the first day,compared with the sham group;the Mfn2 expression of group of thoracic SCI was decreased entirely and obviously from the third day after operation,with significantly statistical difference(P<0.05);the expression of GFAP increased gradually with the development of injury,and the difference was statistically significant from the third day after the operation(P<0.05). ConclusionAfter SCI,the expression of GFAP which is the specific marker of astrocytes is increased. At the same time,the products of Mfn2 which is proved to be a hyperplasia suppressor gene is decreased. So there is an inversed relationship between the expression of Mfn2 and the activation and proliferation of astrocytes after SCI.

【Key words】spinal cord injury; chondriosome; astrocyte; protein; rats

文章編號：1009-4237(2016)03-0153-05

通訊作者：鄭莉,E-mail:1078616252@qq.com

【中圖分類號】R 651.2

【文獻標識碼】A【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.03.008

(收稿日期：2015-07-17； 修回日期： 2016-01-05)

附屬同濟醫院創傷外科(蔣猛，易成臘，白祥軍)