清肺通絡(luò)膏對(duì)呼吸道合胞病毒感染大鼠肺組織PI3K-AKT-NFκB信號(hào)通路的影響

劉小雪，　王雪峰，　張秀英，　王藝歡，　王思源，　南春紅

110032 沈陽(yáng)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(劉小雪，張秀英，王藝歡)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(王雪峰，王思源，南春紅)

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實(shí)驗(yàn)論著

清肺通絡(luò)膏對(duì)呼吸道合胞病毒感染大鼠肺組織PI3K-AKT-NFκB信號(hào)通路的影響

劉小雪，王雪峰，張秀英，王藝歡，王思源，南春紅

110032 沈陽(yáng)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(劉小雪，張秀英，王藝歡)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(王雪峰，王思源，南春紅)

【摘要】目的觀察清肺通絡(luò)膏對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)感染大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響，探討清肺通絡(luò)膏對(duì)PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組各10只，模型組、治療組均給予RSV滴鼻接種3 d，治療組于接毒第1天予清肺通絡(luò)膏背部貼敷，連續(xù)7 d。于造模第7天后取大鼠肺組織，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組大鼠肺組織中PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RSV感染大鼠時(shí)激活了PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路，清肺通絡(luò)膏能夠抑制PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)，可能是清肺通絡(luò)膏干預(yù)RSV肺炎的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】肺炎；呼吸道合胞病毒；清肺通絡(luò)膏；PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路；大鼠

呼吸道合胞病毒(respreatory syncytial virus，RSV)是一種RNA病毒，屬副黏液病毒科，是導(dǎo)致嬰幼兒患病毒性肺炎和毛細(xì)支氣管炎的主要病原體之一[1]。中醫(yī)藥治療病毒性感染疾病獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，療效確切，耐藥性低，不良反應(yīng)少，臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，采用中藥外敷治療RSV肺炎患兒，不僅療效顯著，而且解決了嬰幼兒給藥困難、家長(zhǎng)不易接受等問(wèn)題。清肺通絡(luò)膏是根據(jù)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑敷胸散改良而來(lái)，主要組成為大黃、黃芩、大蒜，寒熱兼顧、升降相宜。現(xiàn)代研究證明，大黃對(duì)流感病毒、呼吸道合胞病毒等十幾種對(duì)人類危害極大的病毒有顯著的抑制作用[2]；黃芩有抗病毒、抗菌、抗氧化等多方面的藥理作用[3]；大蒜也具有抗菌、抗病毒生物活性[4]。王雪峰教授多年臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)清肺通絡(luò)膏對(duì)多種小兒呼吸道疾病有明顯療效，但對(duì)其作用機(jī)制尚不明確，為進(jìn)一步探討該臨床有效復(fù)方的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法，觀察清肺通絡(luò)膏對(duì)RSV感染大鼠肺組織中PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)的影響，為清肺通絡(luò)膏的臨床應(yīng)用提供更有利的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量60～80 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。

1.2細(xì)胞與病毒人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒實(shí)驗(yàn)室提供；RSV(long株)，購(gòu)自于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室，保存在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室液氮罐中。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品及清肺通絡(luò)膏制備大黃、黃芩均購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室鑒定均為正品。清肺通絡(luò)膏制備，大黃∶黃芩=1∶1，采用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2 h，合并濾液，減壓干燥研成粉末，避光冷藏。于給藥前用大蒜汁將干燥粉末調(diào)成膏狀備用。

1.4主要試劑一抗：兔抗PI3K多克隆抗體(批號(hào)：ab151549，購(gòu)自Abcam公司)、兔抗AKT1/2多克隆抗體(批號(hào)：ab6076，購(gòu)自Abcam公司)，兔抗NF-κBp65抗體(批號(hào)：bs-0465R，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：AD0807，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(批號(hào)：15111A06，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.5主要設(shè)備IP1020型自動(dòng)組織脫水處理機(jī)、Autostainer XL型自動(dòng)組織染色機(jī)、EG1105型石蠟包埋機(jī)、A020221型烘漂處理儀、RM2135型精密轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，BX50F4型系統(tǒng)生物顯微鏡(OLYMPUS)，計(jì)算機(jī)圖像分析儀(北京航空大學(xué)圖像中心)。

1.6實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1分組、造模及給藥將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、治療組各10只。將全部大鼠置于SPF級(jí)清潔籠內(nèi)喂養(yǎng)，3 d后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。正常組經(jīng)鼻滴加生理鹽水0.1 mL，其余兩組鼻腔接種RSV原毒液0.1 mL，連續(xù)3 d。接毒第1天，治療組大鼠給予脫毛處理，使大鼠背部皮膚充分暴露，脫毛面積約2 cm×2 cm大小，并給予清肺通絡(luò)膏背部外敷治療，生藥量每次0.6 g，每日1次，連續(xù)敷藥7 d進(jìn)行干預(yù)。正常組和模型組不予干預(yù)。

1.6.2標(biāo)本取材及指標(biāo)測(cè)定各組大鼠于造模第7天后取材，取材前8 h禁食水。斷髓處死各組大鼠，無(wú)菌開(kāi)胸，取出肺臟，生理鹽水沖洗干凈后于4%多聚甲醛固定，固定完全后脫水、包埋、切片。按SP免疫組化檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)上的檢測(cè)步驟進(jìn)行大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65的測(cè)定。顯微鏡觀察，每張切片任選5個(gè)視野(×200)，采用北航分析系統(tǒng)圖像采集，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析、測(cè)定每個(gè)肺組織的陽(yáng)性顆粒(棕黃色)的平均光密度。

2結(jié)果

各組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1～3(見(jiàn)封三)。從圖1～3可以看出，正常組、模型組、治療組各組大鼠肺組織免疫組化染色后均可觀察到肺組織中存在棕黃色陽(yáng)性顆粒，說(shuō)明各組大鼠肺組織中蛋白PI3K、AKT1/2、NF-κB p65均有表達(dá)。

表1　各組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

分析各組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白平均光密度，從表1可知，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)最強(qiáng)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

RSV感染是造成嬰兒期住院的常見(jiàn)病原，首次感染多見(jiàn)于1歲以內(nèi)的嬰兒，感染率高，深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院2012年3月至2013年3月兒科收治住院的急性下呼吸道感染患兒病毒陽(yáng)性標(biāo)本中，呼吸道合胞病毒陽(yáng)性率最高，為47.00%[5]，并且與支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[6]。小兒RSV肺炎屬于中醫(yī)的“肺炎喘嗽”范疇。小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，肺常不足，衛(wèi)外不固，由口鼻或皮毛感受六淫邪氣，致肺失宣肅，肺氣郁閉，郁久化熱，導(dǎo)致肺炎喘嗽發(fā)生。王雪峰教授結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和小兒肺炎的病因病機(jī)提出了“從肺毒熱論治”的理論[7]，在小兒肺炎實(shí)熱證階段盡早使用入肺經(jīng)的清熱解毒藥；又因肺與大腸相表里，肺之毒熱易移大腸，所以將清熱解毒、瀉下等藥物配伍后外敷于背部肺俞、膏肓等穴位，既可清肺之毒熱又可通導(dǎo)大腸，使毒熱之邪得出路而解。小兒肺炎實(shí)熱證階段采用清肺通絡(luò)膏外敷，藥物經(jīng)皮透入，經(jīng)腧穴由表入里，循經(jīng)絡(luò)內(nèi)達(dá)臟腑，達(dá)到內(nèi)病外治的效果。清肺通絡(luò)膏的君臣藥為大黃、黃芩，大黃歸胃、大腸、肝、脾經(jīng)，瀉下攻積，清熱瀉火，具有蕩滌胃腸實(shí)熱積滯的作用；黃芩歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，清熱燥濕，瀉火解毒，長(zhǎng)于清除中上二焦?jié)駸幔蛔粢源笏猓笏馑幮孕翜兀舛練⑾x(chóng)，制約大黃及黃芩的苦寒之性，全方配伍簡(jiǎn)明扼要、寒熱兼顧、升降相宜。

本研究中，采用RSV(long株)經(jīng)鼻腔接種SD大鼠，建立大鼠RSV肺炎模型。模型組與正常組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)均上調(diào)，說(shuō)明RSV感染大鼠后存在PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的激活。許多研究表明，PI3K能夠影響氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，干預(yù)Th2細(xì)胞、B細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過(guò)程[8]。RSV感染機(jī)體后，上調(diào)S1P(sphingosine1-phosphate)，進(jìn)而介導(dǎo)PI3K-Akt信號(hào)通路的激活[9]，一旦PI3K-Akt信號(hào)通路被抑制，RSV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡就會(huì)大量發(fā)生[10]。PI3K是由一個(gè)p110催化亞基和一個(gè)p85調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，能將PIP2磷酸化成PIP3。PIP3可以將具有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子(如Akt)招募到質(zhì)膜上進(jìn)行活化，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)通路[11]。Akt是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶，具有絲-蘇氨酸激酶活性。活化的Akt能夠通過(guò)活化IKK使IκB磷酸化，從而使NF-κB從IκB/NF-κB復(fù)合物中解離下來(lái)重新恢復(fù)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)均較模型組低，說(shuō)明清肺通絡(luò)膏對(duì)RSV感染大鼠發(fā)揮一定的治療作用，其作用機(jī)制可能就是抑制PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的激活。本實(shí)驗(yàn)僅從蛋白水平觀察了RSV感染后PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的情況及清肺通絡(luò)膏對(duì)PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步還可以從分子水平進(jìn)行研究。

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(本文編輯：劉穎)

Effect of Qingfei Tongluo ointment on the PI3K/Akt/NF-kappaB signaling in rats infected with RSV

LIUXiaoxue,WANGXuefeng,ZHANGXiuying,WANGYihuan,WANGSiyuan,NANChunhong.

LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and the mechanism of Qingfei Tongluo ointment on the expression of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 in rats infected with RSV.MethodsTotally 30 rats were randomized into 3 groups,namely,normal group,model group,treatment group,with 10 rats in each.The rats of the last two groups were made into RSV infection models.For treatment group Qingfei Tongluo ointment was given at the first day of the experiment,once daily for seven consecutive days.Examine the levels of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 in lung tissue,using the method of immunohistochemistry.ResultsThe result of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 expression in lung tissue showed that：compared with the normal group，the model group had significant difference(P<0.05);compared with the model group，the treatment group had significant difference(P<0.05).ConclusionQingfei Tongluo ointment is an effective drug for external use in RSV infection;its action mechanism may be through adjusting the PI3K/Akt/NF-κB signaling.

【Keywords】Pneumonia;RSV;Qingfei Tongluo ointment;PI3K/Akt/NF-kappaB signaling;Rats

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273800)

作者簡(jiǎn)介：劉小雪(1988-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)碩士研究生在讀。研究方向：病毒性疾病的中醫(yī)藥治療通訊作者：王雪峰，E-mail：lnzywsf@163.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.02.004

【中圖分類號(hào)】R725.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-3865(2016)02-0136-03

(收稿日期：2016-03-19)