左旋組氨酸對匹羅卡品致癇大鼠海馬區神經肽Y表達和神經細胞凋亡影響的實驗研究*

翟 煜，霍小林，王永利

(1.天津醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，天津 300070 2.中國科學院電工研究所，北京 100000 3.天津醫科大學總醫院神經外科，天津 300070)

左旋組氨酸對匹羅卡品致癇大鼠海馬區神經肽Y表達和神經細胞凋亡影響的實驗研究*

翟 煜1，霍小林2，王永利3**

(1.天津醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，天津 300070 2.中國科學院電工研究所，北京 100000 3.天津醫科大學總醫院神經外科，天津 300070)

摘 要:目的:實驗研究左旋組氨酸對匹羅卡品致癇大鼠海馬區神經肽Y表達和神經細胞凋亡影響。方法:統計分析60只Ⅱ級健康純系雄性SD大鼠的相關資料。結果:研究組和對照組大鼠建模成功率78.3%(18/ 23)、77.3%(17/ 22)之間的差異無統計學意義(P＞0.05)；研究組大鼠的潛伏期顯著長于對照組(P＜0.05)，癇波頻率低于對照組(P＜0.05)，大發作次數少于對照組(P＜0.05)，成功建模動物模型后1d、2d、3dCA1區、CA3區、齒狀回神經肽Y陽性細胞計數均低于對照組(P＜0.05)，凋亡染色陽性細胞計數均顯著低于對照組(P＜0.05)。結論:左旋組氨酸能夠有效降低匹羅卡品致癇大鼠海馬區神經肽Y表達和神經細胞凋亡數值，具有抗癇作用。

關鍵詞:左旋組氨酸； 匹羅卡品致癇大鼠； 海馬區神經肽Y表達； 神經細胞凋亡

**通訊作者

為臨床有效治療癲癇提供科學依據，本研究對60只Ⅱ級健康純系雄性SD大鼠的相關資料進行了統計分析，實驗研究了左旋組氨酸對匹羅卡品致癇大鼠海馬區神經肽Y表達和神經細胞凋亡影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組:購買北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供的60只Ⅱ級健康純系雄性SD大鼠，體重240～260g，平均體重為(250±10)g。所有大鼠均接受常規飼養、自由進食等。隨機將這些大鼠分為研究組(n=30)和對照組(n = 30)兩組。給予研究組匹羅卡品聯合左旋組氨酸治療，給予對照組單純匹羅卡品治療。給予兩組腹腔注射350mg/ kg體重劑量匹羅卡品，以對顳葉癲癇模型進行誘導，依據Racine標準中動物行為特征分癲癇為5個級別，如果大鼠嘴部和面部運動具有節律性，代表為咀嚼、頭部陣攣，則評定為Ⅰ級；如果大鼠點頭，則評定為Ⅱ級；如果大鼠前肢出現陣攣現象，則評定為Ⅲ級；如果大鼠身體出現上舉現象，則評定為Ⅳ級；如果大鼠身體出現上舉伴跌倒現象，則評定為Ⅴ級。癲癇模型成功誘導標準為Ⅲ級以上，將沒有達到標準的大鼠剔除，另行補充。

1.2方 法

1.2.1藥品和試劑:購買Sigma公司生產的左旋組氨酸(L-His)、匹羅卡品(PLO)等，購買廣州市鴻洲實驗器材有限公司生產的磷酸鹽緩沖液，購買德國寶靈曼公司生產的原位細胞凋亡檢測試劑盒，購買天津市化學試劑廠生產的水合氯醛(AGAC)及分析純。

1.2.2皮質腦電圖檢測:給予大鼠模型腹腔注射300mg/ kg水合氯醛進行麻醉，將腦電記錄電極安置其中。固定后將骨孔從大鼠顱骨雙側額葉皮質、頂葉皮質相應部位打開，骨孔直徑為1mm，將銀、氯化銀球形記錄電極分別插入。在大鼠前鹵后2mm安置參考電極。術后進行5d的休養，然后開始皮質腦電圖檢測。將記錄裝置連接起來，對腦電路記錄的正確可靠情況進行認真檢查。給予對照組大鼠腹腔注射350mg/ kg匹羅卡品建模，然后對其2h皮質腦電圖進行連續記錄；給予干預組大鼠腹腔注射300mg/ kg左旋組氨酸，1h后給予其腹腔注射250mg/ kg匹羅卡品建模。將2h內皮質腦電圖變化數據連續記錄[1]。

1.2.3皮質腦電圖分析指標:腹腔注射匹羅卡品到癇波首次出現的時間段為潛伏期。為時程為1min的腦電圖中尖波/棘波數值計數，每隔12min 1次，2h共將采集10個數值，每分鐘癇波頻率即為該組數據平均數。大發作標準為連續癇波時間在10s以上，將數據詳細記錄，將每組數據平均值及標準差計算出來[2]。

1.2.4神經肽Y檢測:應用鏈霉卵白素-過氧化物酶(Histontain-SP)試劑盒，運用第二代LAB-SA技術檢測神經肽Y。運用親和純化的二抗和Histontain-SP軛合物對已經在組織細胞抗原上結合的一抗進行檢測，通過酶催化底物對所形成的抗原/抗體/酶復合物進行反映，從而將抗原的位置及分布確定下來[3～5]。

1.2.5病理組織取材方法:成功建模動物模型后1d、2d、3d將每組10只建模大鼠分別抽取出來，給予其腹腔注射350mg/ kg水合氯醛試液進行麻醉，開胸在4℃的環境下行升主動脈灌流250mL 4%多聚甲醛+250mL生理鹽水。取出腦，將其固定在4%多聚甲醛溶液中。將海馬取出來，將最大剖面冠狀切開，將厚度為6μm的石蠟切片制備出來，進行細胞凋亡染色，染色過程中嚴格依據凋亡檢測試劑盒設計程序進行[6]。

1.2.6凋亡染色分析:凋亡細胞的細胞核在凋亡染色后的顏色為棕色或棕褐色，光學顯微鏡下對CA1區、CA3區、齒狀回進行觀察，高倍視野(10×20)下將6個區域從130μm×130μm網格中隨機選取出來，區域面積為0.0169m2，計數神經肽Y陽性細胞數及染色凋亡的陽性細胞，對顆粒細胞層NPY陽性反應密度比值進行檢測，檢測過程中用圖像分析系統，將每組數據平均值及標準差值計算出來。

1.3統計學分析:用軟件SPSS20.0對數據進行統計分析，用(±s)表示實驗數據，單因素用方差分析(One -Way ANOVA)，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1兩組大鼠建模成功情況比較:研究組和對照組大鼠建模成功率78.3%(18/23)、77.3%(17/22)之間的差異不顯著(P＞0.05)，具體見表1。

2.2兩組潛伏期、癇波頻率及大發作次數比較:研究組大鼠的潛伏期顯著長于對照組(P＜0.05)，癇波頻率顯著低于對照組(P＜0.05)，大發作次數顯著少于對照組(P＜0.05)，具體見表2。

表1　兩組大鼠建模成功情況比較n(%)

2.3兩組大鼠各時間點海馬各區神經肽Y陽性細胞計數變化情況比較:研究組大鼠成功建模動物模型后1d、2d、3d CA1區、CA3區、齒狀回神經肽Y陽性細胞計數均顯著低于對照組(P＜0.05)，具體見表3。

表2　兩組潛伏期、癇波頻率及大發作次數比較(±s)

表2　兩組潛伏期、癇波頻率及大發作次數比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別　只數　潛伏期(s)癇波頻率( / min)大發作次數(次)研究組　30　475±112.5* 136.7±24.6* 21.8±3.56*對照組　30　117.6±37.13 386.68±60.38 94.2±23.2

表3　兩組大鼠各時間點海馬各區神經肽Y陽性細胞計數變化情況比較(個，±s)

表3　兩組大鼠各時間點海馬各區神經肽Y陽性細胞計數變化情況比較(個，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別　只數　時間　只數　CA1區　CA3區　齒狀回研究組　30　1d　10　24.30±3.35*　31.40±2.13*　19.10±1.79* 2d　10　25.20±1.14*　34.50±5.52*　20.40±0.84* 3d　10　25.60±3.05*　32.60±1.95*　19.80±2.17*對照組　30　1d　10　37.60±4.98　49.20±10.38　31.20±3.83 2d　10　55.20±4.09　64.60±11.10　31.60±1.14 3d　10　60.00±1.00　80.67±8.39　29.33±1.53

2.4兩組大鼠各時間點海馬各區凋亡染色陽性細胞計數變化情況比較:研究組大鼠成功建模動物模型后1d、2d、3dCA1區、CA3區、齒狀回凋亡染色陽性細胞計數均顯著低于對照組(P＜0.05)，見表4。

表4　兩組大鼠各時間點海馬各區凋亡染色陽性細胞計數變化情況比較(個，±s)

表4　兩組大鼠各時間點海馬各區凋亡染色陽性細胞計數變化情況比較(個，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別　只數　時間　只數　CA1區　CA3區　齒狀回研究組　30　1d　10　23.30±6.83*　24.56±5.41*　21.83±4.05* 2d　10　19.46±4.93*　21.66±7.43*　17.37±4.95* 3d　10　15.74±6.92*　20.13±5.20*　16.47±5.57*對照組　30　1d　10　44.2±1.30　47.4±2.30　33.4±2.07 2d　10　36.8±0.84　28.2±3.42　29.6±1.14 3d　10　40.5±2.12　37±7.07　32±1.41

3 討 論

本研究結果表明，研究組和對照組大鼠建模成功率78.3%(18/23)、77.3%(17/22)之間的差異不顯著(P＞0.05)；研究組大鼠的潛伏期顯著長于對照組(P＜0.05)，癇波頻率顯著低于對照組(P＜0.05)，大發作次數顯著少于對照組(P＜0.05)，成功建模動物模型后1d、2d、3d CA1區、CA3區、齒狀回神經肽Y陽性細胞計數均顯著低于對照組(P＜0.05)，凋亡染色陽性細胞計數均顯著低于對照組(P＜0.05)，充分說明了左旋組氨酸能夠有效降低匹羅卡品致癇大鼠海馬區神經肽Y表達和神經細胞凋亡數值，同時顯著延長大鼠的潛伏期，降低大鼠的癇波頻率，減少大鼠的大發作次數，具有抗癇作用，值得臨床推廣。

參考文獻:

[1] 葛宇星.ClC-2對慢性顳葉癲癇大鼠海馬CA1區α5亞基-GABA_AR介導緊張性抑制的影響[D].復旦大學，2012.

[2] 程蕊.NAP對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用[D].山東大學，2012.

[3] 張帆.重組腺相關病毒神經肽Y基因轉染對海人酸致癇大鼠海馬突觸重建的影響及其機制研究[D].河北醫科大學，2013.

[4] 董長征.重組腺相關病毒神經肽Y基因轉染對紅藻氨酸致癇大鼠癲癇發作的影響及其機制探討[D].河北醫科大學，2013.

[5] 孟春想.柴胡皂苷a對難治性癲癇大鼠癇性發作及P-GP表達的影響[D].南方醫科大學，2012.

[6] 黃彥思，林云賓，馮婉萍，等.癲癇兒童智能和適應能力分析及抗癲癇藥物治療的影響[J].河北醫學，2015，20(8): 1390～1394.

Experimental Study of Influences of L-histidine in Y Neuropeptide Expression on the Hippocampus and Neuronal Apoptosis of Pilocarpine-induced Seizures Rats

ZHAI Yu，HUO Xiaolin，WANG Yongli
(Physiology and Pathophysiology Department of Basic Medical Faculty，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Abstract:Objective: To experimentally study the influences of L-histidine on Y neuropeptide expression in the hippocampus and neuronal apoptosis of pilocarpine-induced seizures rats. Method: The relevant information of 60 cases of Class II healthy pure male SD rats were statistically analyzed. Result: The difference of modeling success rate between the study group and the control group was not significant (P＞0.05)；The latency of the study group was significantly longer than that of the control group ( P＜0.05)，epilepsy wave frequency was significantly lower (P＜0.05)，the large number of attacks was significantly lower (P＜0.05)，the modeled after successful animal model of 1d，2d，3d CA1 area，CA3 region，tooth Neuropeptide Y-shaped back positive cell counts were significantly lower (P＜0.05)，the apoptosis staining positive cell counts were significantly lower than those of the control group (P＜0.05). Conclusion: L-histidine can ef-book=2,ebook=6fectively reduce the L-histidine in Y neuropeptide expression in the hippocampus and neuronal apoptosis value of pilocarpine-induced seizures rats，it has anti-epileptic effect.

Key words:L-histidine； Pilocarpine-induced seizures rats； Y neuropeptide expression in the hippocampus； Neuronal apoptosis

文獻標識碼:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.01.001

文章編號:1006-6233(2016)01-0001-04

*基金項目:國家自然科學基金，(編號:50307013)