小兒急性肺損傷患者血清miR-155的表達水平及其臨床意義

崔秀平 周子健

小兒急性肺損傷患者血清miR-155的表達水平及其臨床意義

崔秀平 周子健

目的 通過檢測小兒急性肺損傷（acute lung injury,ALI）患者血清中miR-155的表達水平，探討其在診斷和評估小兒ALI中的臨床意義。方法 選擇符小兒AMI診斷的患者30例作為研究對象，分別于明確診斷后1、3、5、7 d取患者血清樣本，采用實時熒光定量RT-PCR（RT-PCR）檢測血清miR-155表達改變情況；并與30例正常人進行對照。探討血清miR-155的表達水平在診斷和評估小兒ALI上的臨床價值。結果 小兒ALI患者血清miR-155表達水平在明確診斷后1、3、5、7 d時均明顯高于正常對照組（P＜0.05）。隨著病情的緩解，血清miR-155表達呈逐漸下降趨勢。Pearson相關分析顯示，血清miR-155與APACHE-II評分具有顯著相關性（P＜0.05）。結論 在小兒ALI患者血清中血清miR-155的表達水平不僅能夠成為新的ALI檢測標記物，還可以作為患者病情監測的臨床指標。

急性肺損傷；兒童；miR-155；血清

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）以肺部炎癥炎癥和肺毛細血管通透性增加為特征的臨床綜合征。ALI導致彌漫性肺間質及肺泡水腫，臨床上表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，嚴重時則進展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）。由于小兒肺部發育尚不夠成熟和免疫力低下，因此ALI在小兒中的發病率要高于成人。近年流行病學統計顯示國外ALI占兒科重癥監護病房收治的10%[1]。ALI屬于兒科臨床危重癥之一，由于目前臨床上缺乏具有較高敏感性和特異性的早期診斷ALI的生物標記物，因此診治難度較大。微小RNA（miRNA）是近年來發現的一類長度約20～25 nt的非編碼調控單鏈小分子RNA。研究顯示，miRNA在調控腫瘤發生發展、炎癥免疫反應等一系列重要生理病理過程起著非常重要的調控作用[2]。最新的研究證實，miRNAs能在血液中穩定存在，且其表達譜和表達水平改變情況也與疾病有關[3]。因此，科學家們推測miRNA可能是一個理想的生物檢測標志物。miR-155是目前已知的在炎癥和免疫反應起重要調控作用的miRNA。本次研究我們通過檢測小兒ALI患者血清中miR-155的表達水平，探討其在診斷和評估小兒ALI中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月～2015年5月在梅河口市中心醫院住院并確診的小兒ALI患者30例作為研究對象。所有小兒ALI患者均符合我國1999年中華醫學會推薦的ALI診斷標準：（1）有導致ALI的高危因素；（2）急性起病，呼吸頻數增加和（或）呼吸窘迫；（3）低氧血癥：ALI時PaO2/ FiO2≤300 mmHg；（4）胸部X線檢查示雙肺浸潤陰影；（5）肺動脈楔壓（PCWP）≤18 mmHg或臨床上能除外心源性肺水腫。其中男19例，女11例，年齡1～11歲，平均年齡（3.5±1.2）歲。另選擇30例正常小兒作為對照組。所有入選小兒家長研究前均被告知簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）血清樣本采集：所有研究對象均在各個時間點采集靜脈血5 mL，室溫下自然凝固20 min，然后2 000 rpm/ min條件下離心15 min，吸出上層血清，放入-80℃冰箱待實驗。（2）主要設備及試劑：RNAisoTMPlus和RT-PCR試劑盒（Takara公司）；mirVanaTMmiRNA Isolation Kit和miScript Reverse Transcription Kit（Ambion公司）；miR-1及U6引物序列購于上海吉凱基因化學技術有限公司；微量高速離心機（Eppendorf公司）；ABI PRISM 7900實時熒光定量PCR儀（ABI公司）。（3）miR-155的檢測：①血清總RNA提取：采用RNAisoTMPlus并按照操作說明提取血清中的總RNA，異丙醇沉淀法濃縮

RNA，NanoDrop? ND-1000檢測RNA濃度并評估純度，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。②逆轉錄（RT）反應：采用miScript Reverse Transcription Kit并按照實驗步驟說明進行操作。建立20μL RT混合反應體系：dNTP（2.5 mM each）2μL；Total RNA 0.3 ug；RT特異引物（1 uM）：0.5μL；MMLV反轉錄酶（10U/μL）：2μL；RNA酶抑制劑（40 u/ μL）：0.3μL；10×RT Buffer 2μL；加入無RNA酶水至總體積20μL。反應條件：16℃：30 min；40℃：40 min；85℃：5 min。③PCR反應：構建20μL反應體系：通用引物1μL，目的引物1μL，QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10μL，模板CDNA 1μL，無RNA酶水7μL。按以下程序進行擴增：95℃，3 min；40個PCR循環（95℃，15 s；60℃，30 s；70℃，30 s）。實驗重復3次。以U6 snRNA作為內參，數據采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料結果用“x±s”表示，治療前后及組間比較用t檢驗，計數資料以構成比表示，用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA質量檢測結果 提取血清RNA經檢測吸光度（A）值A260/A280在1.6～1.8，表明RNA濃度和純度較高，無DNA及蛋白質污染。變性凝膠電泳結果顯示為3個清晰條帶，18 S和28 S條帶清晰無明顯拖尾，證實RNA提取成功，無RNA降解發生。

2.2 小兒ALI患者和正常小兒血清miR-155表達比較 正常小兒血清中只表達較低水平的miR-155表，約為（0.12±0.02）；小兒ALI患者血清miR-155表達水平較正常小兒有顯著的升高，約為（1.41±0.36）；兩者比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組血清miR-1表達情況比較

2.3 不同時間點小兒ALI患者血清miR-155表達情況小兒ALI患者血清miR-155表達水平在明確診斷后1、3、5、7 d時均明顯高于正常對照組，3 d左右達到高峰（P＜0.05）。隨著病情的緩解，血清miR-155表達呈逐漸下降趨勢。見圖2。

圖2 不同時間點小兒ALI患者血清miR-155表達

2.4 小兒ALI患者血清miR-155表達與APACHE-II評分的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，小兒ALI患者血清miR-155表達與APACHE-II評分的相關系數r=0.68，呈明顯正相關（P＜0.05）。

3 討論

ALI發病機制錯綜復雜，涉及多種病理生理機制，目前已知各種致病因素導致的全身炎癥反應是小兒ARDS的根本原因。ALI疾病進展迅速，如果不能得到及時有效的治療。ALI會發展為ARDS，嚴重威脅患者的生命[4]。據流行病學資料顯示，美國ALI/ARDS的年總發病率為19萬，其病死率高達30%～40%[5]。小兒ALI早期往往缺乏特異性表現，待出現典型臨床表現時疾病往往已進展至中晚期。因此，尋找能早期診斷小兒ALI，且特異性、敏感性更高的標志物，對于及時開展治療，改善患者預后是至關重要的。近年來，雖然在ALI的生物標記物研究上已經獲得一些進展，如肺細胞及基質損傷的生物標記物（AECⅠ、Ⅱ損傷標記物、層黏連蛋白、血管性血友病因子）和炎癥反應標記物（TNF-α、IL-6、IL-8）[6-8]。但目前臨床上尚缺乏具有較高敏感性和特異性的診斷ALI的生物標記物。

miRNA是近年來發現的一類非編碼調控單鏈小分子RNA。研究證實，miRNA可通過轉錄后水平下調炎癥因子和炎癥因子信號通路的受體來調控失衡的炎癥反應，因此在炎癥免疫反應過程起著非常重要的調控作用。值得關注的是，由于miRNA與疾病的發生及發展密切相關，且在患者病變組織、血液中均可以發現異常表達的，與疾病發展密切關聯的miRNAs。因此，miRNA具備成為新的疾病檢測標志物的潛力[9]。

miR-155是近年來發現的免疫系統相關的miRNA之一，其位于人類21號染色體上B-cell Integration Cluster（bic）基因的第三個外顯子內。研究表明，LPS刺激可導致人免疫細胞中miR-155表達升高，且這種改變與Toll樣受體（TLR）的活化有關，提示miR-155可能通過轉錄后水平下調炎癥因子和炎癥因子信號通路的受體來調控失衡的炎癥反應，因而在人體的炎癥反應和免疫調節過程中發揮重要作用[10-11]。

綜上所述，小兒ALI患者血清miR-155表達水平較正常小兒顯著升高。隨著病情的緩解，血清miR-155表達呈逐漸下降趨勢。Pearson相關分析顯血清miR-155與APACHE-II評分呈明顯正相關。以上數據結果表明，血清miR-155具備成為早期診斷小兒ALI的新指標。而其血清水平的下降也預示著疾病的好轉，提示血清miR-155水平也可作為判斷ALI預后的重要指標。此外，由于小兒ALI的整個病理過程主要由炎癥反應介導，因此，能夠調控炎癥反應的miR-155也可能成為ALI治療的潛在靶點。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.30.007

吉林 135000 梅河口市中心醫院兒科 （崔秀平） 梅河口市中心醫院心內科（周子健）