TLR4受體拮抗劑對Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性因子分泌的影響

趙　超, 宋書蓮, 周　潔, 金國良, 2, 周　妍, 2,韓晶晶, 2, 花　放, 2, 3

( 1. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)科, 江蘇 徐州, 221006;2. 徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所, 江蘇 徐州, 221002;3. 江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室, 江蘇 徐州, 221002)

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TLR4受體拮抗劑對Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性因子分泌的影響

趙超1, 宋書蓮1, 周潔1, 金國良1, 2, 周妍1, 2,韓晶晶1, 2, 花放1, 2, 3

( 1. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)科, 江蘇 徐州, 221006;2. 徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所, 江蘇 徐州, 221002;3. 江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室, 江蘇 徐州, 221002)

摘要:目的探討體外培養(yǎng)條件下Toll樣受體4(TLR4)拮抗劑對β淀粉樣蛋白1-42片段(Aβ1-42)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性因子分泌的影響。方法用不同濃度的Aβ1-42(終濃度為0、1、5、10、20、40、80 μmol/L)及TAK-242(終濃度1 μmol/L)處理小鼠小膠質(zhì)細胞(BV2)，24 h后取其上清干預(yù)小鼠海馬神經(jīng)元(HT22)。48 h后，應(yīng)用CCK8方法檢測HT22細胞的存活，ELISA方法檢測BV2細胞上清液中TNF-α、IL-1β水平。結(jié)果與空白對照組相比，Aβ1-42直接作用于體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞后，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)TNF-α、IL-1分泌的增加(P<0.05)；與空白對照組相比，Aβ1-42誘導(dǎo)組培養(yǎng)液干預(yù)的HT22細胞存活率顯著下降(P<0.05)。給予TLR4拮抗劑TAK-242干預(yù)后，Aβ1-42誘導(dǎo)TNF-α、IL-1分泌的作用被抑制，細胞分泌TNF-α、IL-1β水平較Aβ1-42誘導(dǎo)組顯著降低(P<0.05)，HT22細胞存活率也顯著提高(P<0.05)。結(jié)論阻斷TLR4可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性因子的分泌，并減輕活化的小膠質(zhì)細胞對海馬神經(jīng)元的損害。

關(guān)鍵詞:Aβ1-42; TLR4拮抗劑; 小膠質(zhì)細胞; 海馬神經(jīng)元

阿爾茨海默病(AD)又稱早老性癡呆，是以進行性記憶減退、認(rèn)知障礙、人格改變等為主要特征的一種慢性進行性神經(jīng)變性疾病。關(guān)于AD的發(fā)病機制，目前認(rèn)為與β淀粉樣蛋白(Aβ)沉淀誘發(fā)小膠質(zhì)細胞(MG)的活化引起的腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。活化的小膠質(zhì)細胞既可以吞噬和清除老年斑(SP)，從而保護神經(jīng)元，又可以促進炎性因子的釋放，加重神經(jīng)元的損傷、功能障礙甚至凋亡[2]。既往的研究[3]顯示，Toll樣受體(TLRs)參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在免疫炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起著重要作用。TLR4在介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的活化和炎性因子的合成與釋放中起重要作用[4]。有研究[5]顯示TLR4參與了AD的病理生理過程，TLR4基因敲除小鼠纖維素型Aβ的沉積較野生型小鼠增加，TLR4參與Aβ的攝取和清除[6]。然而, TLR4在AD腦組織內(nèi)的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥反應(yīng)中的作用尚不清楚。本文應(yīng)用Aβ1-42體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞(BV2)活化，研究TLR4特異性拮抗劑TAK-242對Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性因子的表達及其對海馬神經(jīng)元損傷的影響，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

小鼠小膠質(zhì)細胞株(BV2細胞)及小鼠海馬神經(jīng)細胞株(HT22細胞)為美國東田納西州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈予。DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基均購于HyClone公司[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，貨號SH30022.01B、SH30023.01B]、胎牛血清購于Gibco公司(北京智杰方遠科技有限公司，貨號16000-044)；Aβ1-42購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號A118755)，使用前置于37℃水浴箱孵育1周成聚集態(tài)。小鼠ELISA TNF-α、IL-1β試劑盒均購于eBioscience公司(San Diego，CA，USA，貨號88-7324、88-7013)；CCK8試劑盒購于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司(貨號CK04)；酶標(biāo)儀購于BioTek Instruments，Inc(美國伯騰儀器有限公司北京代表處，型號ELx800)；TLR4-MyD88特異性抑制劑CLI-095購于InvivoGen公司(San Diego，CA92121-USA，貨號tlrl-cli95)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng): BV2細胞的體外培養(yǎng)：細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換培養(yǎng)液，待細胞長至80%左右時，按1∶4傳代。

HT22細胞的體外培養(yǎng): 細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，待細胞長至80%左右時，按1∶2傳代。

1.2.2BV2細胞處理: 將BV2細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 24 h后鏡下觀察細胞長至70%左右，加入Aβ1-42，終濃度分別為0、1、5、10、20、40、80 μmol/L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 收集細胞培養(yǎng)上清液, -20 ℃保存待用。ELISA方法檢測不同濃度組上清液中TNF-α含量。

1.2.3神經(jīng)元HT22的干預(yù): HT22細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)，進行細胞毒性試驗。HT22用無血清培養(yǎng)基饑餓4 h后用DMEM/F12培養(yǎng)基及BV2培養(yǎng)的上清液混合培養(yǎng)48 h。用細胞增殖檢測方法CCK8法檢測細胞存活率，以Aβ1-42處理組與未處理組吸光度值的百分比表示。

1.3實驗分組

本實驗第一部分應(yīng)用不同濃度Aβ1-42(終濃度為0、1、5、10、20、40、80 μmol/L)處理小膠質(zhì)細胞(BV2細胞)，24 h后檢測上清炎癥因子TNF-α的含量，以及用該上清處理的海馬神經(jīng)元(HT22細胞)的存活率，選擇Aβ1-42處理BV2細胞最適宜濃度。

實驗第二部分將BV2細胞分為4組，即空白對照組(培養(yǎng)基組，用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)，TAK-242處理組(TAK-242，用1 μmol/L TAK-242培養(yǎng)24 h)，Aβ1-42誘導(dǎo)組(Aβ1-42，選擇40 μmol/L作為最適宜濃度處理BV2細胞)和Aβ1-42聯(lián)合TAK-242組(TAK-242 + Aβ1-42，用1 μmol/LTAK-242處理BV2細胞1 h后，加終濃度為40 μmol/L的Aβ1-42)。

1.4檢測方法

1.4.1CCK8法檢測細胞存活率: BV2細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后鏡下觀察細胞長至70%左右，按上述分組處理24 h后，1 000 g、20 min離心收集細胞培養(yǎng)上清。HT22用無血清培養(yǎng)基饑餓4 h后用DMEM/F12培養(yǎng)基及BV2使用過一次的上清液混合培養(yǎng)48 h，每孔中加入100 μL不含血清培養(yǎng)基+10 μL CCK8，于37℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育1 h。ELx800型酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度值，細胞生存率以(實驗組-調(diào)零組)與(對照組-調(diào)零組)吸光度值的百分比表示。

1.4.2ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量: 按上述實驗分組處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書，按每孔100 μL分別將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液加入對應(yīng)孔中，顯色后以96孔酶標(biāo)儀于450 nm處測OD值(光密度)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各組上清液中TNF-α、IL-1β含量，每一個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，實驗結(jié)果以P表示，采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度的Aβ1-42對BV2細胞釋放的TNF-α的影響

Aβ1-42處理的BV2細胞的上清中可檢測到TNF-α。Aβ1-42濃度(5、10、20、40、80 μmol/L)處理的實驗組與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。此外，TNF-α水平的增加與Aβ1-42(1、5、10、20、40、80 μmol/L)呈濃度依賴性關(guān)系。見圖1、2。

2.2不同濃度Aβ1-42對HT22細胞的毒性作用

為了評估Aβ1-42對HT22的損傷作用，用不同濃度的Aβ1-42處理BV2細胞24 h，取其上清液處理HT22細胞48 h。CCK8結(jié)果顯示，低濃度Aβ1-42(1、5、10 μmol/L)作用時未顯著影響HT22存活率。隨著Aβ1-42濃度的升高(20、40、80 μmol/L)，HT22存活率與對照組相比顯著降低(P<0.05)。HT22細胞存活率隨著Aβ1-42濃度的升高而逐漸降低，存在著量效關(guān)系。 Aβ1-42達到對HT22細胞的半數(shù)抑制率(IC50)的濃度約為40 μmol/L。見圖3。

圖1 Aβ1-42處理24h后BV2上清中TNF-α含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 Aβ1-42處理24h后BV2上清中TNF-α含量的變化(n=6,與對照組比較,#P<0.05)

與對照組比較,#P<0.05;與40μmol/L的Aβ1-42組比較,*P<0.05圖3 不同濃度Aβ1-42處理BV224h后上清對HT22細胞活力的影響(n=6)

2.3TLR4拮抗劑TAK-242對Aβ1-42誘導(dǎo)的小

膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-1β釋放的影響與對照組相比，TAK-242單獨處理未影響TNF-α和IL-1β和表達(P>0.05)，而Aβ1-42顯著增加TNF-α和IL-1β的釋放(P<0.001)。TLR4拮抗劑TAK-242可以抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β的釋放。見圖4、5、6。

圖4 Aβ1-42處理24h后BV2上清中TNF-α含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 Aβ1-42處理24h后小膠質(zhì)細胞上清中TNF-α的表達(n=6,與對照組比較,#P<0.05)

圖6 Aβ1-42處理24h后小膠質(zhì)細胞上清中IL-1β的表達(n=6,與對照組比較,#P<0.05)

2.4TLR4拮抗劑對Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞釋放產(chǎn)物對神經(jīng)元存活的影響

實驗結(jié)果顯示，Aβ1-42處理的BV2細胞的上清液可以顯著減低HT22細胞的存活率(與對照組比較,P<0.05)；TAK-242處理BV2可以減少Aβ1-42誘導(dǎo)的HT22細胞死亡，HT22細胞的存活率在Aβ1-42組與Aβ1-42+TAK-242組之間有顯著性差異(P<0.05)。見圖7。

與對照組比較,#P<0.05;與Aβ比較,*P<0.05;與TAK-242比較,@P<0.05圖7 TAK-242對Aβ1-42誘導(dǎo)HT22細胞存活率的影響(n=6)

3討論

阿爾茨海默病是一種與智力相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以進行性記憶減退、認(rèn)知障礙、人格改變等為主要特征。其發(fā)病機制尚不明確，尚無有效的治療方法，目前已被公認(rèn)的致病機制為神經(jīng)元纖維tau蛋白的纏結(jié)和與年齡相關(guān)的β-淀粉樣蛋白的沉積[7-8]，這兩方面均導(dǎo)致了慢性炎性反應(yīng)，從而引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在AD患者中，小膠質(zhì)細胞被Aβ激活成反應(yīng)性細胞[9]。活化的小膠質(zhì)細胞一方面通過TLR4的表達上調(diào)，導(dǎo)致下游炎性因子的釋放量增加，加重神經(jīng)元的損傷、功能障礙甚至凋亡；另一方面，釋放一些促進神經(jīng)修復(fù)和具有神經(jīng)保護作用的營養(yǎng)因子[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞BV2在Aβ25-35刺激后，TLR4蛋白和RNA表達水平均有所上調(diào)。阿爾茲海默病模型小鼠TLR4相關(guān)的TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17的表達均顯著上調(diào)[12]。由此可見，TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能通過上調(diào)炎性因子的表達參與AD的發(fā)生發(fā)展過程，因此抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)對抑制AD的病理過程非常重要。

以往的研究[13]發(fā)現(xiàn)Toll樣受體在免疫炎性反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，其中TLR4與其配體結(jié)合，激活下游調(diào)節(jié)蛋白TRIF和MyD88調(diào)節(jié)的信號通路，TLR4可以在相應(yīng)條件下選擇性激活不同的信號通路。當(dāng)MyD88信號通路激活時，轉(zhuǎn)錄核因子NF-kB和/或激活蛋白1(AP-1)被激活[14]，促使TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子和協(xié)同刺激分子的大量表達[15]。而TRIF依賴性信號通路最終可活化干擾素調(diào)節(jié)因子3，使得IFN-β、IL-10、TGF-β等抗炎因子合成增加[16-17]。

TAK-242是一種外源性小分子TLR4信號通路特異性抑制劑[18]，通過選擇性地抑制TLR4胞內(nèi)信號通路，抑制NO等炎性因子的產(chǎn)生，明顯緩解LPS引起的低血壓，從而緩解內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀，提高存活率[19]。其可完全性地阻斷LPS通過MAPK和NF-kB信號通路所引起的炎性反應(yīng)，其阻斷作用部分來源于MAPKs通路[20]。在體實驗結(jié)果[21]表明，TAK-242可通過血腦屏障，阻斷TLR4信號通路，抑制下游蛋白磷酸化，下調(diào)sTNF RII、MCP-1等炎性因子的表達，改善腦神經(jīng)功能，改善小鼠腦缺血/再灌注損傷。但是TLR4抑制劑是否能抑制Aβ1-42激活的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥因子的釋放，改善其導(dǎo)致的神經(jīng)細胞死亡尚無研究結(jié)論。

本實驗用不同濃度的Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)Aβ1-42激活小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β等炎性因子，且Aβ1-42與BV2分泌的TNF-α、IL-1β有劑量相關(guān)性。此外，由Aβ1-42處理的小膠質(zhì)細胞的上清液可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的死亡，且與Aβ1-42的濃度相關(guān)。Aβ1-42達到對HT22細胞的半數(shù)抑制率(IC50)的濃度約為40 μmol/L。該實驗結(jié)果顯示，Aβ1-42可以激化小膠質(zhì)細胞促進其炎癥因子的釋放。Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞釋放產(chǎn)物可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的死亡。

LPS可以激活小膠質(zhì)細胞，引起TLR4超表達和下游炎性因子NO、前列腺素2(PGE2)[22]。有研究[23]表明，Aβ25-35可以激活小膠質(zhì)細胞，并上調(diào)TLR4蛋白的表達，腫瘤壞死因子(NF-κB)轉(zhuǎn)錄活性增強。本實驗應(yīng)用TLR4拮抗劑TAK-242阻斷TLR4通路可以顯著抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥因子的釋放并減輕其導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元的死亡。該結(jié)果表明，Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥因子的釋放是通過TLR4介導(dǎo)的信號通路調(diào)節(jié)的，阻斷TLR4信號通路抑制炎性因子的釋放減輕神經(jīng)元死亡，TLR4介導(dǎo)的信號通路可能是研究AD的發(fā)病機制和干預(yù)措施的新的靶點。

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Effect of TLR4 antagonist on the secretion of inflammatory cytokines in microglia induced by Aβ1-42

ZHAO Chao1, SONG Shulian1, ZHOU Jie1, JING Guoliang1, 2,ZHOU Yan1, 2, HAN Jingjing1, 2, HUA Fang1, 2, 3

(1.DepartmentofNeurology,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221006；2.InstituteofNervousSystemDisease,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221002；3.KeyLaboratoryofAnesthesiologyofJiangsuProvince,Xuzhou,Jiangsu, 221002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonist on the secretion of inflammatory cytokines in microglia induced by Amyloid β protein 1-42 (Aβ1-42). MethodsCultured microglia cells (BV2) were stimulated with different concentrations of Aβ1-42 (final concentrations of 0, 1, 5, 10, 20, 40 and 80 μmol/L) and TLR4 antagonist (TAK-242, 1 μmol/L) for 24 h, respectively. The supernatants were used to treat cultured hippocampus neurons (HT22) for 48 h. The viability of HT22 cells was tested by CCK8 kit, and levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin l-β (IL-1β) in the culture medium were detected by method of ELISA. ResultsCompared with control group, treatment of Aβ1-42 significantly increased the levels of TNF-α and IL-1β in cultured microglia cells in a dose-dependent manner (P<0.05). In addition, Aβ1-42 treated supernatants induced a significant decrease of viability in cultured HT22 cells compared with non supernatant treated control (P<0.05). Compared with non-TAK-242 treated group, TAK-242 significantly inhibited the increase of TNF-α and IL-1β in cultured microglia cells (P<0.05), and attenuated the neuronal death induced by the supernatants from cultured microglia treated by Aβ1-42 (P<0.05). ConclusionBlocking TLR4 by antagonist can inhibit the release of cytokines from microglia induced by Aβ1-42, and attenuate the damage of neurons induced by supernatants from cultured microglia treated with Aβ1-42.

KEYWORDS:Aβ1-42; TLR4 antagonist; microglia; hippocampal neurons

中圖分類號:R 745.1

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-001-05

DOI:10.7619/jcmp.201609001

通信作者:花放, 男, 江蘇特聘教授、醫(yī)學(xué)博士、博士生導(dǎo)師, E-mail: huafang@xzmc.edu.cn

基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目(81271268); 國家自然科學(xué)基金面上項目(81571469); 2012年江蘇特聘教授項目;

收稿日期:2015-12-16

江蘇省2014年雙創(chuàng)團隊項目。