益氣活血中藥對急性心肌梗死病人血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達的影響

朱敬偉，戴國華，姚　靜，劉　寧，宋憲波，馬培澤

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)(濟南 250014)；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3.山東省濟寧市中醫(yī)院；4.山東省威海市中醫(yī)院

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益氣活血中藥對急性心肌梗死病人血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達的影響

朱敬偉1，戴國華2，姚靜1，劉寧3，宋憲波3，馬培澤4

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)(濟南 250014)；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3.山東省濟寧市中醫(yī)院；4.山東省威海市中醫(yī)院

摘要：目的觀察益氣活血中藥對急性心肌梗死(AMI)病人血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達的影響。方法將AMI病人30例隨機分為治療組和對照組各15例，治療組予常規(guī)西藥聯(lián)合益氣活血中藥治療，對照組予常規(guī)西藥治療，療程2周。健康志愿者10名為健康組。健康志愿者于入組時，AMI病人于入院后1 h、第3天、第7天、第14天分別抽取肘靜脈血，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測miR-223-3p、 miR-132-5p的表達情況。結(jié)果AMI病人入院早期miR-223-3p出現(xiàn)高表達、miR-132-5p出現(xiàn)低表達，與健康志愿者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-132-5p及肌鈣蛋白I(cTnI)比較，miR-223-3p顯示出高表達、高敏感性的特點。與對照組比較，治療組治療后病人血漿 miR-223-3p表達降低、miR-132-5p表達上調(diào)更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；cTnI于24 h上升和第3天下降更為明顯(P<0.05)。結(jié)論益氣活血中藥聯(lián)合常規(guī)西藥治療AMI較單純常規(guī)西藥治療臨床療效較好，可能與調(diào)節(jié)miR-223-3p、miR-132-5p的表達有關(guān)，miR-223-3p有望成為新的AMI早期診斷標志物。

關(guān)鍵詞：急性心肌梗死；益氣活血中藥； miR-223-3p；miR-132-5p；肌鈣蛋白I；胸痹

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的急危重癥，早期診斷及治療尤為重要。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約25% AMI病人發(fā)病早期并沒有典型的臨床癥狀[1]，目前首選的心肌損傷標志物心肌肌鈣蛋白在AMI發(fā)病初期多無明顯異常，亦或超過臨界值仍缺乏診斷特異性，有必要尋找更準確、更敏感的生化標志物。前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，促進缺血心肌血管新生的核心microRNA為表達上調(diào)的miR-223-3p、表達下調(diào)的miR-132-5p。臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p在AMI發(fā)病早期即可出現(xiàn)高表達，且比肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌鈣蛋白I(cTnI)的時間窗更早[2-5]。本研究在此基礎(chǔ)上，進一步觀察益氣活血中藥治療后AMI病人血漿miR-223-3p、miR-132-5p的表達變化，分析其對AMI早期診斷的臨床價值，為心肌梗死中醫(yī)藥治療提供新的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2013年7月—2014年12月收治的30例AMI住院病人，參照2012年ESC/ACC/AHA/WHF工作聯(lián)盟發(fā)布修訂后的第3版心肌梗死全球統(tǒng)一定義，隨機分為治療組、對照組各 15例。治療組和對照組各脫落1例，治療組14例，年齡(58.21±7.55)歲，對照組14例，年齡(55.87±8.29)歲。同時選10名健康志愿者為健康組，年齡(56.72±5.37)歲。各組病人性別、年齡、AMI類型、冠心病危險因素等資料經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2治療方法對照組予常規(guī)西藥治療，包括：阿司匹林、硝酸酯、低分子肝素、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和(或)血管緊張素受體拮抗劑。治療組予常規(guī)西藥聯(lián)合益氣活血中藥治療，益氣活血中藥包括：參麥注射液、參芪扶正注射液、丹紅注射液、芪參益氣滴丸。療程2周。

1.3主要試劑及儀器Trizol(Invitrogen life technologies)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技公司)，SYBR Premix Ex TaqTM real-time PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，高速低溫離心機(美國Thermo Scientific公司)，實時定量PCR擴增儀、反轉(zhuǎn)錄儀(美國Applied Biosystems公司)，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.4觀察指標

1.4.1中醫(yī)證候積分參照國家藥品監(jiān)督管理局2002年頒布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中的“中藥新藥治療冠心病心絞痛的臨床研究指導(dǎo)原則”。

1.4.2cTnI水平檢測抽取病人入院后1 h、24 h、第3天、第7天、第14天肘靜脈血，免疫印跡法檢測血漿cTnI水平。

1.4.3檢測血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達情況抽取病人入院后1 h、第3天、第7天、第14天以及健康志愿者肘靜脈血，real-time PCR檢測血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達情況。TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的純度及濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；選miR-93作為內(nèi)參，逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下，miR-93 GSP：5′GGCAAAGTGCTGTTCGTG3′，R：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′； miR-223-3p GSP：5′GGGGTGTCAGTTTGTCAAA3′，R：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′； miR-132-5p GSP：5′GGACCGTGGCTTTCGATT3′，R：5′GTGCGTGTCGTGGAGTCG(GSP是對應(yīng)microRNA的特異引物，R是與RT引物相匹配的引物)。real-time PCR按照說明書進行操作。獲得產(chǎn)物擴增曲線、融解曲線及CT值(每個反應(yīng)管中的熒光信號到達設(shè)定的閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。計算各樣本的△Ct值(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)，組間表達差異用2-△△Ct(△△Ct=△Ct治療組-△Ct對照組)表示。

2結(jié)果

2.1中醫(yī)證候積分比較對照組和治療組治療前的中醫(yī)證候積分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療組治療后中醫(yī)證候積分低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，治療組證候改善情況明顯優(yōu)于對照組。詳見表1。

表1　治療組與對照組中醫(yī)證候積分比較(±s) 　 分

2.2cTnI比較入院1 h已開始升高，24 h達到高峰，第2天開始下降并于第7天接近正常水平。而治療組于入院24 h和第3天cTnI升高程度明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表2。

表2　治療組與對照組cTnI的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果(±s) 　ng/mL

2.3血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達情況2.3.1健康組、AMI組血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達比較AMI病人入院1 h miR-223-3p的表達水平較健康者明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-132-5p表達水平較健康者明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表3。miR-223-3p、miR-132-5p與miR-93擴增及溶解曲線見圖1。

表3　健康組、AMI組miR-223-3p、miR-132-5p的Ct值(±s)

注：A代表miR-223-3p擴增曲線；B代表miR-223-3p熔解曲線；C代表miR-132-5p擴增曲線；D代表miR-132-5p熔解曲線；E代表miR-93擴增曲線；F代表miR-93熔解曲線。

圖1real-time PCR檢測miR-223-3p、miR-132-5p擴增曲線及熔解曲線

2.3.2治療組與對照組血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達比較治療后，兩組AMI病人miR-223-3p表達均出現(xiàn)不同程度下降，治療組下降更為顯著(P<0.05)；而miR-132-5p表達均出現(xiàn)不同程度的上升，治療組上升更為顯著(P<0.05)。詳見表4。

表4　治療組與對照組治療前后miR-223-3p、miR-132-5p表達( 2-ΔΔCT)(±s)

2.3.3益氣活血中藥對AMI病人血漿miR-223-3p、miR-132-5p表達的影響AMI病人入院1 h的血漿miR-223-3p水平即達峰值，以后逐漸降低，治療第7天后下降減緩。治療組miR-223-3p水平下降較對照組更明顯。miR-132-5p的表達水平持續(xù)降低至入院后第3天，之后逐漸上升并持續(xù)到第14天。從治療后第3天開始，治療組miR-132-5p表達水平上升更明顯。詳見表5、圖2。

表5　miR-223-3p、miR-132-5p的表達量比較(2-ΔΔCT)(±s)

圖2入院后病人血漿miR-223-3p、miR-132-5p的表達情況

3討論

microRNA是一類在進化上具有高度保守性的非編碼小分子RNA，具有組織特異性和時序性，只在特定的組織和特定的發(fā)育階段表達，生物信息學(xué)分析，人類約30%的基因受microRNA調(diào)控，表明microRNA可能影響所有的信號途徑[6]。隨著microRNA研究的不斷開展，microRNA相關(guān)的檢測技術(shù)已趨成熟。通過microRNA表達譜芯片和real-time PCR技術(shù)可以精確地定量分析microRNA的表達[7]，經(jīng)常用于驗證預(yù)測的microRNA。中藥有效成分具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的作用特點，而且中藥復(fù)方在相互配伍后的作用較為復(fù)雜，可通過調(diào)節(jié)microRNA的表達發(fā)揮多基因治療的效果。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究使人們對血管新生機制的認識日漸深入，益氣活血中藥在促血管新生方面的作用亦已得到證實。芪參益氣滴丸是益氣活血中藥治療冠心病心肌缺血的代表性品種之一。相關(guān)研究證實該藥可顯著促進缺血心肌血管的新生，但目前基于microRNA探討中藥促血管生成的研究報道尚少[8-9]。以往關(guān)于缺血心肌血管新生的過程及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，多集中于促血管生長因子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制方面。2006年研究人員首次報道了microRNA的表達特征與小鼠和人類的心臟衰竭以及心肌肥厚相關(guān)[10]，進而引發(fā)了醫(yī)學(xué)界對microRNA在心血管中作用的深入研究。

本研究在前期動物實驗和臨床研究的基礎(chǔ)上，進一步觀察益氣活血中藥對AMI病人血漿中miR-223-3p、miR-132-5p的表達影響。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病初期，治療組和對照組血漿miR-223-3p水平較健康組升高，而miR-132-5p水平較健康組降低，治療后兩組miR-223-3p出現(xiàn)不同程度的下降，而miR-132-5p出現(xiàn)上升，與對照組比較，治療組改善更為明顯(P<0.05)。說明益氣活血中藥聯(lián)合常規(guī)西藥對AMI病人血漿miR-223-3p及miR-132-5p的調(diào)節(jié)作用均優(yōu)于常規(guī)西藥治療。同時，治療后，治療組病人主要臨床癥狀減輕較對照組更為顯著，因此推測在心肌梗死發(fā)病過程中，病情的發(fā)展可能與調(diào)節(jié)miR-223-3p、miR-132-5p的表達有關(guān)。在外周循環(huán)血漿中microRNA具有一定的穩(wěn)定性和易檢測性[11]，且隨著生物科技的發(fā)展，對于microRNA的檢測及分析將會更加精確和迅速，因此，在未來心肌損傷的診治過程中，miR-223-3p和miR-132-5p很有可能成為重要生物學(xué)標記物。另外，受試者血漿中miR-223-3p的基礎(chǔ)表達量明顯高于miR-132-5p，同時結(jié)果提示，AMI病人入院早期血漿miR-223-3p及miR-132-5p即出現(xiàn)差異表達，而miR-223-3p較miR-132-5p、cTnI、CK-MB等常規(guī)AMI診斷標志物具有更早的表達時間窗以及更早的達峰時間，這一結(jié)果表明，在心肌梗死發(fā)病初期，與miR-132-5p、cTnI、CK-MB比較，miR-223-3p具有高表達、高度敏感性的特點，因此早期檢測miR-223-3p的表達量對急性心肌梗死的診斷可能具有更高的臨床價值。

肌鈣蛋白是臨床上目前最常用的心肌損傷標志物，通常在心肌梗死后4 h～8 h內(nèi)才開始升高[12]，且根據(jù)心肌損傷程度具有較大差異。而經(jīng)過動物實驗證實，microRNA在進行冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)后1 h即可升高，其敏感性顯著高于肌鈣蛋白[13]。在診斷靈敏性上，microRNA比現(xiàn)有的cTnI及CK-MB等具有更高的特異性及靈敏性。本研究結(jié)果顯示，兩組cTnI于入院1 h已開始升高，第3天時達到高峰，第7天大致下降到正常水平；而與對照組比較，治療組在入院24 h和入院第3天時cTnI升高程度較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明運用益氣活血中藥治療能減輕心肌損害，并使心肌損傷在更短的時間內(nèi)恢復(fù)。而前期研究結(jié)果表明，miR-223-3p相較于cTnI和CK-MB具有更早的時間窗，且與cTnI呈正相關(guān)關(guān)系[5]，表明microRNA可以作為早期診斷AMI的標志物，為血管再通提供更加寶貴的時間。檢測效率方面，microRNA主要通過PCR儀分析，比肌鈣蛋白的檢測更加快捷方便。因此，microRNA相比于肌鈣蛋白更具有臨床實用價值，對心肌梗死的診斷具有更強的靈敏性。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-12-18)

中圖分類號：R542.2R289.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.004

文章編號：1672-1349(2016)09-0939-05

通訊作者：戴國華，E-mail: daigh2004@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81173441)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(No.2015-297)