缺氧條件下RhoA/Rho激酶及eNOS在血管內皮細胞表達的研究

金洪國，周敏，金美玉，寇雪蓮，何松彬，唐維國（溫州醫科大學附屬舟山醫院 神經內科，浙江 舟山 316021）

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缺氧條件下RhoA/Rho激酶及eNOS在血管內皮細胞表達的研究

金洪國，周敏，金美玉，寇雪蓮，何松彬，唐維國
（溫州醫科大學附屬舟山醫院 神經內科，浙江 舟山 316021）

［摘 要］目的：建立穩定的體外細胞缺氧模型，探討人體臍靜脈內皮細胞（HUVEC）在缺氧條件下RhoA蛋白和Rho激酶對其內皮細胞內皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達的影響。方法：利用jetPEI-HUVEC、siRNA分別轉染SH-SY5Y細胞、HEK293細胞和HUVEC后制備體外細胞缺氧模型，通過細胞裂解對相關蛋白進行免疫印跡分析。結果：常氧條件下RhoA蛋白在HUVEC中表達水平較低，但在缺氧條件下培育5 h后表達增加，同時缺氧3 h后Rho激酶表達增加，5 h后達高峰，而eNOS的表達恰恰相反。缺氧條件下，活化型RhoA蛋白下調eNOS的表達，而siRNA使RhoA蛋白表達減少從而上調eNOS的表達；Rho結合域抑制Rho激酶活性而上調eNOS的表達。結論：RhoA蛋白和Rho激酶的表達及活化抑制內皮細胞中eNOS的表達，因此可以通過某些藥物如他汀類或Rho激酶抑制劑，抑制RhoA蛋白和Rho激酶的活性，從而增加eNOS的表達水平，對心腦血管疾病產生保護作用。

［關鍵詞］Rho激酶；內皮型一氧化氮合酶；內皮細胞；RhoA；siRNA

近年的研究提示小G蛋白RhoA在血管的各種細胞功能調控中起著重要的作用。ROCK2是RhoA的下游效應分子之一，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與RhoA-GTP結合時即可被激活［1］。Rho激酶調節應力纖維形成，介導平滑肌細胞收縮、增殖和遷移［2］。最近有研究發現Rho激酶參與腦和冠狀動脈痙攣［3-4］、高血壓病［5］、血管炎癥與重塑［6］，以及動脈粥樣硬化［7］的發生。在血管內皮細胞，L-精氨酸在內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）氧化催化作用下生成一氧化氮（NO）。NO不僅可以維持血管的正常狀態和完整性，在調節血管張力和腦血流量方面也起著重要作用［8-9］。因此，提高eNOS表達，提升NO水平對腦血管疾病產生有益的影響［8，10-11］。Rho激酶可以下調eNOS的表達，影響NO的生成［12-13］。RhoA/Rho激酶調節eNOS表達的相關機制尚未見報道。本研究通過分子生物學方法，揭示缺氧條件下RhoA/Rho激酶調節eNOS在血管內皮細胞表達的相關機制。

1　材料和方法

1.1材料 SH-SY5Y細胞和HEK293細胞［美國典型培養物細胞庫（American Type Culture）］培養在含有10%胎牛血清（FBS），100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle氏培養基中。3種人體臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）細胞系（Kurabo公司，日本大阪）培育在Hu-media EB2（Kurabo公司）媒介質液中，內添2% FBS、10 ng/mL的人表皮生長因子、1 μg/mL氫化可的松、5 ng/mL人成纖維細胞生長因子β、10 μg/mL肝素、50 μg/mL慶大霉素和50 ng/mL兩性霉素B。將細胞培育在37 ℃、5% CO2的培養箱中直到缺氧。

1.2試劑 Myc抗體、RhoA抗體、抗α-微管蛋白抗體、抗兔IgG-HRP（美國Santa Cruz公司）；抗Rho/ ROCK2抗體、抗ROKβ/ROCK1抗體和抗eNOS抗體（美國Palo Alto公司）；活化型RhoA的表達載體（pEFBOS-HA-RhoG14V）、完整的Rho激酶（pEF-BOS-Myc/Rho激酶）、活化型Rho激酶（CAT）、Rho結合域（RB）（日本名古屋大學Kozo Kaibuchi教授提供）；轉染試劑jetPEI-HUVEC（法國伊爾基希大學提供）。

1.3方法

1.3.1細胞轉染：①DNA轉染：轉染前1 d，把計數1.5×105的HUVEC鋪板在35 mm的細胞培養基中；對于每孔細胞，使用100 μL的0.9%氯化鈉溶液稀釋6 μg DNA；對于每孔細胞，使用100 μL 0.9%氯化鈉溶液稀釋12 μL轉染試劑jetPEITM-HUVEC；混合稀釋的DNA和稀釋的jetPEITM-HUVEC充分混勻形成轉染復合物；直接將復合物加入到每孔中，搖動培養板輕輕混勻；在37 ℃、5% CO2中保溫4 h后更換生長培養基，再溫育24 h。②siRNA轉染：轉染前1 d，把計數3×105的HUVEC鋪板在35 mm的細胞培養基中；對于每孔細胞，使用175 μL的OptiMEM稀釋375 pmol siRNA；對于每孔細胞，使用17 μL的OptiMEM稀釋8 μL脂質體；混合稀釋的siRNA和稀釋的脂質體充分混勻形成轉染復合物；直接將復合物加入到每孔中，搖動培養板輕輕混勻；在37 ℃、5% CO2中保溫4 h，然后在500 μL含2% FBS的培養基中再溫育24 h。

1.3.2建立缺氧模型［14］：缺氧誘導前24 h，將轉染后的細胞接種在37 ℃、5% CO2、35 mm的培養基中。24 h后培養基換成厭氧培養基，將細胞置于37 ℃，N295%、CO25%的可控厭氧室中，厭氧室中的O2濃度用氧傳感器監測且維持在低于1%。

1.3.3免疫印跡：在規定的時間內使細胞缺氧后，用冰冷的PBS洗滌細胞，轉移至冰冷的含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 μg/mL抑肽酶，10 μg/mL亮抑蛋白肽酶）的細胞裂解液（1%乙基苯基聚乙二醇，50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷，pH=7.4，10%甘油，150 mmol/L 0.9%氯化鈉溶液，1 mmol/L的EDTA，pH=8.0）中，進行免疫印跡［15］。用蛋白質測定試劑盒（美國加州海格立斯，Bio-Rad公司）檢測裂解液中蛋白含量，細胞裂解液用樣品緩沖液混合。取1 μg細胞總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后加入RhoA抗體（1∶1 000）、ROCK2抗體、抗eNOS抗體（1∶1 000）、抗α-微管蛋白抗體（1∶1 000）、或抗Myc抗體（1∶1 000）孵育；放置一定時間后棄一抗，洗膜后加入抗兔IgG-HRP（1∶5 000）；一定時間后棄二抗，洗膜后加入顯色液，用NIH圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值［12，14］。

1.4統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計學處理。計量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析進行分析；計數資料用Fisher精確概率法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1缺氧對RhoA蛋白的影響 將人體不同組織來源的細胞系暴露于缺氧環境中，人表皮細胞系HEK293、神經元細胞系SH-SY5Y和人內皮細胞系HUVEC在常氧條件下培育24 h后置于厭氧室，把培養基換成厭氧培養基。在規定的時間內使細胞缺氧后，裂解細胞，進行免疫印跡。結果發現在常氧條件下HEK293細胞和SH-SY5Y細胞中可以檢測到RhoA蛋白（見圖1A），而HUVEC中RhoA蛋白表達水平較低；隨著缺氧時間的延長，前兩者RhoA蛋白表達逐漸減少（見圖1A），而后者的表達逐漸增加（見圖1B），作為基數對照［12］的α-微管蛋白表達水平在缺氧24 h后也無明顯變化（見圖1A）。對HUVEC中的RhoA蛋白用NIH圖像處理系統進行分析，結果發現在相同的時間點RhoA蛋白表達水平比內參多，且RhoA蛋白的表達在缺氧5 h后顯著增加（見圖1C）。缺氧條件下不同組織來源的細胞RhoA蛋白表達模式不同，內皮細胞系與其他2個細胞系相比表現出不同的特點。

2.2缺氧對Rho激酶的影響 RhoA的下游效應分子之一ROCK2是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶［15］，與RhoAGTP結合后即可被激活［16］。缺氧時HUVEC中RhoA蛋白表達水平增加，缺氧3 h后檢測到Rho激酶（圖1B），5 h后顯著增加（見圖1C）。ROCKs的另一種亞型ROKβ/ROCK1，在缺氧條件下也具有類似的表達模式。

2.3缺氧對eNOS的影響 eNOS的表達能調節血管內皮功能，因此在缺氧條件下也對其進行了研究。eNOS表達在缺氧3 h后才會發生改變，隨著時間的延長逐漸下降（見圖1C），與既往研究發現缺氧誘導eNOS蛋白表達水平下降的結果一致［13］。

圖1　缺氧對不同來源細胞RhoA蛋白的影響

2.4缺氧條件下RhoA蛋白對eNOS的影響 用空載體（對照組）或活化型RhoA（RhoAG14V）的表達載體轉染HUVEC。轉染24 h后，將細胞置于常氧或缺氧條件下5 h，裂解細胞并進行免疫印跡，蛋白質表達水平以α-微管蛋白作為內參。缺氧條件下eNOS蛋白水平低于常氧條件（見圖2A），與在圖1B和1C中的結果相似。已有研究結果發現在哺乳動物細胞中，RhoAG14V可以激活Rho激酶［17］。在缺氧條件下，與用空載體轉染的對照組細胞相比，用RhoAG14V表達載體轉染的細胞eNOS表達水平明顯下降（見圖2A）。與對照組比，常氧條件下2組差異沒有統計學意義（P＞0.05），但用RhoAG14V表達載體轉染的細胞eNOS表達水平也呈現下降趨勢。

2.5RhoA蛋白對eNOS的影響 用非特異性siRNA（對照組）或RhoA siRNA轉染HUVEC，24 h后將細胞在常氧或缺氧條件下培育5 h，然后用相同的方法進行免疫印跡。RhoA siRNA的轉染可以明顯抑制細胞中RhoA蛋白表達［18］。在缺氧條件下內皮細胞系eNOS的表達水平要比在常氧條件下低（見圖2B），與對照組相比，在缺氧條件下抑制RhoA蛋白表達可以明顯上調eNOS的表達（見圖2B）。在常氧條件下2組差異無統計學意義（P＞0.05），但抑制RhoA蛋白表達后eNOS蛋白表達水平呈現上升趨勢。

圖2　缺氧條件下RhoA蛋白對eNOS的影響

2.6缺氧條件下Rho激酶對eNOS的影響 通過阻止Rho激酶與RhoA結合而抑制內源性Rho激酶的活性（見圖3A）。用圖2的方法將細胞置于常氧或缺氧條件下5 h，Rho激酶表達載體轉染的細胞，無論缺氧與否均可檢測到Rho激酶（見圖3B）。常氧條件下內源性Rho激酶幾乎檢測不到，而在缺氧條件下可以檢測到（見圖3B）。在缺氧和常氧條件下Rho結合域（RB）表達時eNOS表達水平明顯增加（見圖3C）。在常氧條件下，表達活性型Rho激酶（CAT）的細胞eNOS的表達呈現下降趨勢，而在缺氧條件下，與對照組相比eNOS的表達明顯下降（見圖3C）。在常氧條件下表達Rho激酶的細胞中，eNOS蛋白表達與對照組類似，而在缺氧條件下呈現出下降趨勢。

圖3　Rho激酶一級結構示意圖及Rho激酶對eNOS的影響

3　討論

目前的研究結果表明，缺氧可以誘導內皮細胞系RhoA蛋白和Rho激酶水平上調從而抑制eNOS的表達，具體機制可能是由于在缺氧條件下，細胞能量耗竭，抑制需要ATP的泛素-蛋白酶體途徑，從而抑制RhoA蛋白和Rho激酶的降解，增加一氧化氮合酶的活性，抑制血管收縮［19-20］。本研究中，定量分析結果發現，eNOS表達在缺氧5 h后顯著減少。內皮細胞系RhoA/Rho激酶與eNOS的表達對缺氧的反應呈現相反的趨勢。在缺氧條件下RhoA蛋白的表達對eNOS的表達起著負調控作用，在內皮細胞系缺氧誘導RhoA蛋白表達增加而eNOS表達減少，兩者間有相互關聯。在缺氧條件下，內皮細胞系RhoA蛋白的活性和表達可能會抑制eNOS表達。缺氧可以增加內源性RhoA蛋白的水平，且不受外源性RhoAG14V表達的影響。在常氧條件下無法檢測到RhoA的下游效應分子Rho激酶，而在缺氧條件下Rho激酶與RhoA具有協同作用。

據報道，HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類藥物，通過抑制eNOS的mRNA表達，使RhoA蛋白的異戊二烯化作用受到抑制，在缺氧條件下減少eNOS的表達水平和活性［21］。與他汀類藥物類似，在缺氧條件下Rho激酶抑制劑逆轉eNOS表達［13］。Rho激酶抑制劑法舒地爾增加eNOS表達，從而增加eNOS活性和NO的生成［12，22］。既然RhoA蛋白和Rho激酶的表達及活化可以抑制內皮細胞eNOS的表達，那么可以嘗試著通過某些藥物下調RhoA蛋白和Rho激酶的活性，從而上調eNOS的表達水平，對心腦血管疾病產生保護作用。

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（本文編輯：吳彬）

Study on the expression of RhoA/Rho-kinase and eNOS in vascular endothelial cells under hypoxic condi-tion

JIN Hongguo，ZHOU Min，JIN Meiyu，KOU Xuelian，HE Songbin，TANG Weiguo. Department of Neurology，Zhoushan Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University，Zhoushan，316021

Abstract:Objective: To establish stable hypoxic model in vitro and to explore the effect of RhoA protein/ Rho-kinase in human umbilical vein endothelial cell，（HUVEC） on eNOS expression of its endothelial cell under hypoxic condition. Methods: SH-SY5Y cells，HEK293 cells and HUVEC were respectively transfected using jet-PEI-HUVEC and siRNA to prepare cellular hypoxic model，the Western blotting analysis was preformed for the related proteins through cellular lysis. Results: RhoA protein levels in HUVEC were low under normoxic conditions，but were significantly increased after 5 h of hypoxia. Endothelial Rho-kinase expression was not detected until 3 h of hypoxia； such expression remained significantly increased after 5 h. On the other hand，endothelial eNOS expression was similar after 3 h of hypoxia，but was significantly decreased after 5 h. The hypoxiainduced decrease in eNOS expression was significantly enhanced by expression of the constitutively active form of RhoA and significantly inhibited by suppression of RhoA expression by small interfering RNA. The hypoxiainduced decrease in eNOS expression was significantly inhibited when endogenous Rho-kinase activation was inhibited by Rho-binding domain expression. Conclusion: Expression and activation of RhoA and Rho-kinase inhibit eNOS expression in endothelial cells，attempts to down-regulate RhoA and Rho-kinase by multiple drugs，such as statins or Rho-kinase inhibitors，might provide endothelial and cardiovascular benefits through upregulation of eNOS.

Key words:Rho-kinase； eNOS； endothelial cell； RhoA； siRNA

通信作者：唐維國，主任醫師，Email：tangweiguo2003@163. com。

作者簡介：金洪國（1974-），男，吉林延邊人，副主任醫師，博士。

基金項目：浙江省醫藥衛生一般研究計劃項目（2015KYA227）。

收稿日期：2016-01-15

［中圖分類號］R743.9

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.002