熒光PCR技術(shù)在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應(yīng)用

陳玲，魏麗娜，吳步東，馮貞玉，王巍哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱　150000

?

熒光PCR技術(shù)在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應(yīng)用

陳玲，魏麗娜，吳步東，馮貞玉，王巍
哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱150000

［摘要］目的將實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于食品及公共場(chǎng)所從業(yè)人員肛拭標(biāo)本的沙門菌與志賀菌檢測(cè),對(duì)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)WS/T454-2014《從業(yè)人員預(yù)防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗(yàn)方法》技術(shù)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)認(rèn)證，評(píng)價(jià)這一新技術(shù)開展作為快速檢測(cè)從業(yè)人員體檢腸道致病菌（傷寒、痢疾）檢測(cè)工作方法的適用性，以替代落后的細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)手段的可行性。方法對(duì)一定時(shí)間從業(yè)人員體檢的肛拭子,同時(shí)用PCR篩查法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行志賀菌和沙門菌對(duì)比檢測(cè),充分比較兩者的檢出率、靈敏度、特異性、工作效率、人力成本和耗材成本。結(jié)果PCR篩查法陽性檢出率1.6‰;傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽性檢出率0.76‰;PCR篩查法的靈敏度和特異性分別為100%和99.97%,具有操作安全簡(jiǎn)便、結(jié)果客觀性強(qiáng)、方法便于規(guī)范統(tǒng)一、質(zhì)量控制措施可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)。結(jié)論P(yáng)CR篩查法檢測(cè)技術(shù)對(duì)健康體檢人員的腸道致病菌進(jìn)行快速篩查可以使檢驗(yàn)的時(shí)間得以縮短,而且特異度強(qiáng)、靈敏度高,兼具時(shí)效性與客觀性,進(jìn)而防止發(fā)生食物中毒及腸道傳染病傳播。更適合基層實(shí)驗(yàn)室規(guī)范統(tǒng)一地開展健康帶菌檢測(cè)工作。

［關(guān)鍵詞］熒光PCR；傷寒痢疾；快速篩查

食品與公共場(chǎng)所從業(yè)人員攜帶腸道致病菌者，是嚴(yán)重危害公眾健康的重大問題，也是造成食品污染和食物中毒的間接因素。目前哈爾濱市對(duì)從業(yè)人員腸道致病菌的篩查一直沿用傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)方法，通常需要5～7 d才能檢出病原體，存在檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低的缺點(diǎn)［1］。WS/ T454-2014《從業(yè)人員預(yù)防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗(yàn)方法》技術(shù)方案以經(jīng)典培養(yǎng)法為依據(jù)，利用實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)和經(jīng)典培養(yǎng)方法準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，從而探討建立高效、準(zhǔn)確、省力的新方案。

1資料與方法

1.1一般資料

對(duì)哈爾濱市2014年12月—2015年12月從業(yè)人員隨機(jī)抽樣，用肛拭子采集糞便標(biāo)本11 800份，分別用傳統(tǒng)和PCR兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，分比較兩者的檢出率、靈敏度、特異性、工作效率、人力成本和耗材成本，以評(píng)價(jià)新方法的可行性［2］。

1.2儀器設(shè)備

（1）SLAN-96P全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析儀；（2）SCAN-4全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（德國(guó)）。

1.3試劑

（1）沙門氏菌和志賀氏菌雙色實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒及配套采樣器増菌液（深圳市生科源生物公司）［3］；（2）SS瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂（北京陸橋）；（3）沙門氏菌和志賀氏菌診斷血清（寧波天潤(rùn)）。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

對(duì)11800份體檢標(biāo)本參照WS/T454-2014《從業(yè)人員預(yù)防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗(yàn)方法》技術(shù)方案用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)［4］。

（1）標(biāo)本采集。從業(yè)人員體檢使用深圳市生科源技術(shù)有限公司生產(chǎn)的MABSKY多功能采樣器（沙門/志賀通用增菌液型）進(jìn)行標(biāo)本采集。采樣方法：第一，將采樣桿緩慢插入肛門內(nèi)2～3 cm，最大深入長(zhǎng)度不超過5 cm，即采樣桿指示刻度。第二，手腕部輕輕用力使采樣頭貼著直腸內(nèi)壁順時(shí)針旋轉(zhuǎn)1～3圈。將采樣桿輕緩抽出。

（2）標(biāo)本增菌。第一，收集標(biāo)本，并送至檢驗(yàn)室。第二，掰斷采樣器頭部，將采樣器放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行37℃恒溫培養(yǎng)7～24 h。

（3）標(biāo)本處理。①Pooling混合：先將pooling混合管（本案專配耗材，也可使用1.5 mL離心管代替）放置在配套的管架上，然后取前增菌后多功能采樣器，掰斷采樣器頭部，手指輕壓采樣器管壁，直接滴取2滴（約80 чL(zhǎng)）至pooling管。按照每10份標(biāo)本混合成1份混合標(biāo)本的要求進(jìn)行Pooling混合操作。

②離心:標(biāo)本混合完成后,將模塊和標(biāo)本水平對(duì)稱，離心機(jī)內(nèi)以12 000 rpm的離心5 min。

③吸液、混勻:離心完后，首先棄上清，其次加DNA提取液50 чL(zhǎng)/管，懸浮混勻。

④加熱：將盛有混勻的標(biāo)本于100℃加熱5 min。

⑤再離心：標(biāo)本加熱完畢以后，放入離心機(jī)內(nèi)以12 000 rpm的離心2 min。

⑥加樣：第一，按照標(biāo)本數(shù)（N）+陰陽性對(duì)照各一份，計(jì)算需要的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑（N+2）；第二，取出分裝配好的沙門志賀雙色檢測(cè)試劑8聯(lián)PCR反應(yīng)管放于離心甩液器上離心5 s，開蓋待加樣；第三，標(biāo)本離心完畢后，從離心機(jī)內(nèi)取出標(biāo)本，然后取5 чL(zhǎng)上清液,加入到PCR反應(yīng)管管壁內(nèi)，蓋好管蓋轉(zhuǎn)ABI7500儀器上機(jī)檢測(cè)。

（4）熒光PCR檢測(cè)。①標(biāo)本檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)；②標(biāo)本反應(yīng)體系：總體積為25 чL(zhǎng)；③PCR反應(yīng)條件：50℃：2 min，（1個(gè)循環(huán)）；95℃：3 min；（1個(gè)循環(huán)）；95℃：5S，55℃：1 min采集熒光；（40個(gè)循環(huán)）。

（5）培養(yǎng)法確認(rèn)與報(bào)告。①PCR檢測(cè)陰性的標(biāo)本：所有標(biāo)本均報(bào)告為陰性。

②PCR檢測(cè)沙門氏菌陽性的組，將混合標(biāo)本所對(duì)應(yīng)組（10份）標(biāo)本挑出，進(jìn)行沙門顯色/XLD瓊脂平皿劃線分離培養(yǎng)。

③PCR檢測(cè)志賀氏菌陽性的組，將混合標(biāo)本所對(duì)應(yīng)組（10份）標(biāo)本挑出，進(jìn)行XLD/麥康凱瓊脂平皿分離培養(yǎng)。

④增菌后標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)法后期生化血清鑒定。

同時(shí)對(duì)11 800份體檢標(biāo)本參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB-T4789.4-2003）和《食品衛(wèi)生微生物學(xué)志賀氏菌檢驗(yàn)》（GB-T4789.5-2003）進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

（1）兩種方法陽性率對(duì)比，見表1。

表1兩種方法檢測(cè)陽性率對(duì)比

（2） 。

表2沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率對(duì)照

表3志賀氏菌檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率對(duì)照

3討論

該次實(shí)驗(yàn)11 800份標(biāo)本中，檢出沙門菌10例和志賀菌9例（以確診病例為準(zhǔn)），相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度提高［5］。在實(shí)際檢測(cè)工作中，還為從業(yè)人員體檢工作帶來如下進(jìn)步。

3.1采樣環(huán)節(jié)

（1）技術(shù)方案所配套的生科源“多功能采樣器”為一體話專業(yè)設(shè)計(jì)，集合了采樣環(huán)節(jié)所涉及的采樣、運(yùn)輸、增菌、取樣多功能需求。

（2）標(biāo)本采集。多功能采樣器已配置滅菌增菌液，省去了傳統(tǒng)方法的采樣瓶清洗、配液、消毒環(huán)節(jié)，可直接使用。既省去了傳統(tǒng)方法采樣器準(zhǔn)備工作所需大量人工，也消除了該環(huán)節(jié)的污染風(fēng)險(xiǎn)；

（3）標(biāo)本運(yùn)輸。多功能采樣器采用全塑料組件，不破碎、不漏液，可避免標(biāo)本運(yùn)輸過程意外產(chǎn)生的樣本交叉污染［6］。

（4）取樣檢測(cè)。無需開啟采樣器瓶蓋，避免標(biāo)本取樣的操作失誤和標(biāo)本污染［8］。

3.2檢測(cè)環(huán)節(jié)

（1）篩查結(jié)果儀器自動(dòng)判讀，消除主觀因素；（2）檢驗(yàn)時(shí)間大幅縮短；（3）PCR實(shí)驗(yàn)操作一人即可完成，減少了工作量；（4）檢驗(yàn)數(shù)據(jù)電腦管理，原始結(jié)果可追溯。

該文PCR試劑應(yīng)用改良分子信標(biāo)設(shè)計(jì)。由于改良分子信標(biāo)更短，與靶序列結(jié)合更緊密，擴(kuò)增條件要求不嚴(yán)，是在基層能更好利用的PCR方法［8］。綜合來看，該技術(shù)方案為整體技術(shù)方法，提供了從采樣到PCR篩查所需要配套的多功能采樣器、PCR試劑盒以及各技術(shù)環(huán)節(jié)的配套細(xì)節(jié)設(shè)計(jì)［9］。新技術(shù)方案是剛頒布的國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，填補(bǔ)了這一領(lǐng)域的技術(shù)空白，是一個(gè)實(shí)用、簡(jiǎn)便、有效的技術(shù)規(guī)范。

［參考文獻(xiàn)］

［1］韓毅，孫燕萍，周虹.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與分離培養(yǎng)法檢測(cè)食品從業(yè)人員沙門菌和志賀菌的比較研究［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2015（2）：132-135.

［2］沈強(qiáng).實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法在腸道致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防治，2009，25（9）：706-707.

［2］尹榮煥，尹榮蘭，楊玉英，等.PCR技術(shù)檢測(cè)熟肉制品中沙門氏菌的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（2）：222，226.

［3］劉華偉,郭藹光,馬立農(nóng),等.PCR技術(shù)在沙門氏菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004（6）：55-58.

［4］蔣春燕，王泰健，王琴，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005（12）：97-101.

［5］劉家發(fā)，朱建如.食品安全存在的問題及對(duì)策［J］.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005（6）：35-38.

［6］劉紅,楊帆,張笑冰,等.痢疾桿菌全基因組序列及基因組島的分析［J］.中國(guó)工程科學(xué)，2002（10）：40-47.

［7］徐曉靜，文思遠(yuǎn)，韓毅.應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)幾種腸道菌［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007（1）：182-183.

［8］淮亞紅,辛?xí)粤?昝林森,等.LAMP法在牛早期胚胎性別鑒定中的應(yīng)用［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（8）：91-94.

［9］王軍，鄢慶枇，蘇永全，等.溶藻弧菌的間接熒光抗體快速檢測(cè)［J］.海洋科學(xué)，2002（7）：1-4.

Realtime Fluorescence PCR Examination Method is in Rapid Detection of Salmonella and Shigella Among Employees

CHEN Ling,WEI Li-na,WU Bu-dong,FENG Zhen-yu,WANG Wei
Harbin Center for Disease Control and Prevention,Harbin,Heilongjiang Province,150000 China

［Abstract］Objective Real-time fluorescent PCR method was applied to food and public employees anus swabs of specimens of salmonella and shigella detection.FOR the experimental certification on national health standard（WS/T454-2014）.Evaluation applicability of this new method to carry out a rapid detection from employees on physical examination of intestinal pathogenic bacteria（typhoid and dysentery）.Methods Comparison test on anal swab of employees for a period of time by using the PCR method and the classic method at the same time .Fully compared their detection rate,sensitivity,specificity,efficiency,labor and material costs.Results The positive rate of PCR method is 1.6‰and the classic method is 0.76‰.The sensitivity and the specificity of the PCR method is 100%and 99.97%respectively.Method is safe in operation to facilitate unified specification,quality control measures is strong operability,etc.Conclusion Real-time fluorescent PCR method allows rapidly detection of intestinal pathogenic bacteria .The method is high specificity,high sensitivity,both timeliness and objectivity to prevent the occurrence of food poisoning and the spread of intestinal infectious diseases.It is suitable for laboratory to carry out rapid detection from employees on physical examination of intestinal pathogenic bacteria normatively.

［Key words］Realtime PCR；Typhoid and dysentery；Rapid detection

收稿日期：（2016-01-09）

DOI：10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.05.125

［中圖分類號(hào)］R440

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1672-5654（2016）02（b）-0125-03