基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其與MAPK/Erk信號(hào)通路的關(guān)系

鄢燕瓊　陳傳綺　郭鐵成　鐘曉紅　羅千軍　高　文　莊　嚴(yán)

(深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東　深圳　518067)

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基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其與MAPK/Erk信號(hào)通路的關(guān)系

鄢燕瓊陳傳綺郭鐵成鐘曉紅羅千軍高文莊嚴(yán)

(深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東深圳518067)

〔摘要〕目的探討基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1及MAPK/Erk信號(hào)通路抑制劑U0126對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(MRVEC)增殖的影響。方法體外培養(yǎng)的MRVEC采用0、25、50和100 μg/L的SDF-1處理，100 μg/L SDF-1處理體外培養(yǎng)的MRVEC細(xì)胞0、24、48和72 h，采用Western印跡方法檢測(cè)MRVEC細(xì)胞中MAPK/Erk信號(hào)通路的磷酸化活化情況，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)MRVEC細(xì)胞的增殖情況。采用MAPK/Erk信號(hào)通路抑制劑U0126預(yù)處理MRVEC細(xì)胞，觀察MAPK/Erk信號(hào)通路在SDF-1調(diào)控MRVEC細(xì)胞增殖中的作用。結(jié)果與100 μg/L的SDF-1處理組相比，25、50和100 μg/L的SDF-1均可顯著上調(diào)MRVEC細(xì)胞中Erk的磷酸化水平，加強(qiáng)MRVEC細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)，且這種作用具有劑量依賴性。采用Erk信號(hào)通路阻斷劑U0126阻斷MRVEC細(xì)胞中的Erk信號(hào)通路后，SDF-1促M(fèi)RVEC細(xì)胞增殖的能力顯著降低(P<0.01)。結(jié)論胰島素可通過激活MRVEC細(xì)胞中的MAPK/Erk信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)MRVEC細(xì)胞的增殖能力，從而在糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮一定的作用。

〔關(guān)鍵詞〕基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1；視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞；糖尿病；增殖

糖尿病(DM)患者常伴有的微血管病變主要包括DM視網(wǎng)膜病變(DR)和DM腎病(DN)等，DR可導(dǎo)致DM患者視力喪失〔1〕。DR的機(jī)制目前研究還不是很清楚?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1是一種重要的血管生成蛋白，也被稱為CXCL12〔2，3〕，其受體為CXCR4。SDF-1 及其受體CXCR4可通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)從骨髓移向缺血的視網(wǎng)膜，從而促使視網(wǎng)膜受損血管的修復(fù)和新生〔4〕。然而，SDF-1在調(diào)控DM患者DR發(fā)生中的作用機(jī)制還不是很清楚。本文旨在探討SDF-1對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(MRVEC)增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1MRVEC獲取與處理MRVEC獲取及鑒定方法參見文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕，細(xì)胞于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。活化實(shí)驗(yàn)中采用0、25、50、100 μg/L的SDF-1及100 μg/L的SDF-1處理MRVEC 0、24、48和72 h。

1.2細(xì)胞總蛋白提取將處理后的MRVEC采用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后離心5 min；離心后將上清液吸去獲得細(xì)胞沉淀，將蛋白磷酸酶抑制劑與100 μl CytoBuster蛋白提取試劑加入細(xì)胞沉淀后，采用高速渦旋進(jìn)行細(xì)胞裂解25 s，并于室溫下靜置15 min；再次離心15min；離心后取上清部分即為細(xì)胞總蛋白。取出部分檢測(cè)蛋白濃度，剩余細(xì)胞總蛋白采用15 μl管分裝并于-80℃凍存。

1.3BCA法測(cè)定蛋白濃度將標(biāo)準(zhǔn)品BSA進(jìn)行倍比稀釋，操作按照說明書進(jìn)行。取BCA試劑A與試劑B混合，比例按照體積比50∶1混合后得到工作液。依次取200 μl工作液加入96孔板中，后加入25 μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品。每種樣品應(yīng)采用3復(fù)孔。加入完畢后于37℃下孵育30 min，并采用振蕩器進(jìn)行短暫混合。采用波長(zhǎng)562 nm進(jìn)行OD值測(cè)定；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，采用標(biāo)準(zhǔn)品光密度值與濃度梯度數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及所測(cè)得的待測(cè)樣品OD值計(jì)算出各樣品中蛋白濃度。

1.4Western印跡提取等量蛋白并采用濃度為8%～10%的SDS-PAGE分離膠與濃度為5%的濃縮膠進(jìn)行分離，在半干狀態(tài)下轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，并采用濃度為5%的TBST于室溫下封閉60 min后，加入一抗，并于4℃下進(jìn)行過夜孵育。次日將孵育后的產(chǎn)物采用濃度為0.1%的TBST進(jìn)行洗膜，共洗滌3次，5 min/次。洗滌完畢后加入HRP標(biāo)記的二抗，并于室溫下孵育60 min。孵育后采用濃度為0.1%的TBST洗膜1次，選擇Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行顯色。采用β-actin作為對(duì)照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次以上。

1.5四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)檢測(cè)增殖將上述SDF-1處理過的MRVEC，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種至96孔培養(yǎng)板。然后依次取20 μl的MTT加入培養(yǎng)板每孔中。充分作用4 h。將上清液吸去，并加入150 μl的DMSO。采用振蕩器于低速下振蕩10 min，采用490 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。對(duì)于阻斷MAPK/ErK信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)，先采用10 μmol/L的U0126將細(xì)胞預(yù)處理60 min后再加入完全培養(yǎng)基與SDF-1。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MRVEC的鑒定如圖1所示，培養(yǎng)至14 d的MRVEC呈鋪路石樣生長(zhǎng)；同時(shí)，MRVEC Ⅷ因子胞質(zhì)染色呈綠色熒光，Hochest核染色呈藍(lán)色熒光，證明培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)為MRVEC，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2SDF-1對(duì)MRVEC細(xì)胞中Erk蛋白磷酸化水平的作用MRVEC細(xì)胞中ErK蛋白磷酸化水平與SDF-1濃度及處理時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。見圖2。

2.3SDF-1對(duì)MRVEC細(xì)胞增殖的作用隨著SDF-1濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MRVEC細(xì)胞增殖能力逐漸升高(P<0.01)(圖3)。

2.4Erk信號(hào)通路在SDF-1促M(fèi)RVEC細(xì)胞增殖中的作用同SDF-1處理組(3.22±0.86)相比，阻斷MRVEC細(xì)胞中Erk信號(hào)通路后，MRVEC細(xì)胞增殖能力顯著降低(0.63±0.47)(P<0.01)，對(duì)照組為0.58±0.23(圖4)。

圖1　MRVEC的鑒定結(jié)果

圖2　Western印跡檢測(cè)SDF-1對(duì)MRVEC細(xì)胞中Erk蛋白磷酸化水平的影響

A.不同濃度SDF-1處理MRVEC細(xì)胞；B.100 μg/L的SDF-1處理MRVEC細(xì)胞不同時(shí)間圖3　MTT方法檢測(cè)SDF-1對(duì)MRVEC細(xì)胞增殖的影響

3討論

SDF-1是新近發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，和CXCR4共同構(gòu)成特異性的SDF-1/CXCR4軸〔6,7〕。目前已知SDF-1在促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。林安華等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1可通過調(diào)節(jié)CXCR4和VEGF的表達(dá)，進(jìn)而參與DR的發(fā)生和發(fā)展。此外，SDF-1 及其受體CXCR4可通過促進(jìn)EPC從骨髓移向缺血的視網(wǎng)膜處募集，從而促使視網(wǎng)膜受損血管的修復(fù)和新生〔4〕。據(jù)此，SDF-1在DR的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。本研究結(jié)果提示，SDF-1是通過調(diào)控MAPK/Erk信號(hào)通路的活化而促進(jìn)MRVEC增殖。DR發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制可能是通過激活MRVEC中的MAPK/ErK信號(hào)通路，從而起到增強(qiáng)MRVEC增殖能力的作用。本研究為臨床干預(yù)SDF-1/CXCR4 軸，從而治療DR提供一定的理論基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

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3Errede M，Girolamo F，Rizzi M，etal.The contribution of CXCL12-expressing radial glia cells to neuro-vascular patterning during human cerebral cortex development〔J〕.Front Neurosci，2014；15(8)：324.

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8林安華，雷閩湘，張朝云，等.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α對(duì)牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CXCR4和VEGF表達(dá)的影響〔J〕.眼科新進(jìn)展，2009；29(11)：821-4.

〔2015-10-12修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R587

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)08-1836-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.020

第一作者：鄢燕瓊(1976-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病、甲狀腺疾病方面研究。