枸杞多糖對人臍靜脈血管內皮細胞的增殖、遷移及血管形成的影響

尹遜天　王　巍　朱玉峰　白　光

(遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧　錦州　121000)

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枸杞多糖對人臍靜脈血管內皮細胞的增殖、遷移及血管形成的影響

尹遜天王巍朱玉峰白光

(遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的觀察枸杞多糖(LBP)對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)增殖、遷移能力及血管形成的影響。方法在HUVECs分別加入不同濃度的LBP后，應用噻唑藍(MTT)和劃痕實驗方法檢測對HUVECS增殖與遷移的影響。利用基質膠實驗檢測實驗濃度LBP對血管形成作用的影響。結果①MTT 實驗結果表明：隨LBP濃度增加，抑制HUVECs增殖能力增強，同時應用甩片實驗可推斷LBP通過促進HUVECs凋亡而達到抑制細胞增長的作用；②劃痕實驗顯示實驗濃度LBP作用下HUVECs遷移距離較空白對照組具有統計學差異；③實驗濃度LBP可明顯抑制血管形成。結論LBP對HUVECs增殖遷移及血管生成能力具有明顯抑制作用。

〔關鍵詞〕枸杞多糖；人臍靜脈血管內皮細胞；增殖；遷移；血管形成

腫瘤血管生成是所有實體腫瘤的共同特征，是實體腫瘤生長和轉移必須依賴的病理學基礎，與腫瘤的生長、侵襲轉移關系極為密切。因此抗血管生成靶向治療已經成為腫瘤治療的重要策略，本文觀察枸杞多糖(LBP)對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)增殖和遷移作用的影響，并檢測LBP對血管形成的影響。

1資料與方法

1.1一般資料2013年3月至2014年1月我院腫瘤中心實驗室完成。HUVECs由我院腫瘤中心實驗室提供，LBP含量35%，由上海康舟真菌多糖有限公司生產，胰蛋白酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕、二甲基亞砜(DMSO)由美國Sigma公司生產，優級胎牛血清由美國Gibco公司生產，DMEM高糖型培養基由美國 Hyclone公司生產，噻唑藍(MTT)由美國Genview 公司生產。

1.2HUVECs培養方法由37℃體積分數為5%CO2孵育箱中取出T25培養瓶，倒置相差顯微鏡下見HUVECs貼壁生長，生長狀態良好，平鋪培養瓶底部，未見細胞重疊現象，當細胞鋪滿細胞瓶壁80%～90%時，出現生長抑制，進行細胞傳代。具體如下：①將培養瓶內培養液倒掉，用5 ml移液槍將瓶內剩余培養液吸出，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～3遍，動作輕柔，加入0.25%胰蛋白酶消化液3 ml，以胰酶鋪滿培養瓶底部為準，放回孵育箱中，消化1 min；倒置相差顯微鏡下可見細胞回縮、變圓，細胞間隙變寬，少數貼壁細胞懸浮，隨后加入3 ml DMEM高糖培養液終止胰酶消化，同時用5 ml移液槍反復吹打瓶壁，倒置相差顯微鏡下見細胞均無貼壁，呈單個漂浮培養液；②將細胞懸液移入15 ml離心管中，1 200 r/min，離心3 min后，見離心管底部灰白色細胞沉積，用3 ml吸管吸棄上清液，加入3 ml DMEM高糖培養液后反復吹打成單細胞混懸液；③將3 ml細胞混合懸液分別置于3個T25培養瓶中，再將每個T25培養瓶內加入含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液4 ml，放入37℃體積分數為5%CO2孵育箱中繼續培養。

1.3細胞計數用10 μl移液槍抽取內皮細胞培養第2步中3 ml單細胞懸液用于技術，輕打入細胞計數板中，操作輕柔，勿產生氣泡，然后置于倒置相差顯微鏡下計數，取平均值。計數操作重復兩次。細胞數目：4象限細胞數總和/4×107/L。

1.4MTT法測定細胞增殖實驗實驗分為6組，即A～F組，LBP濃度依次為0、20、50、100、200、500 μg/ml，每組均設6個復孔，以減小誤差。

1.5細胞甩片技術應用200 μg/ml LBP常規培養HUVECs 24 h，取處于對數期生長的HUVECs，通過上述細胞培養技術及細胞計數方法，利用D-PBS溶液配置HUVECs單細胞懸液，調整細胞濃度至2×105/ml，應用100 μl移液槍抽取單細胞懸液100 μl，加入甩片槽中，調整甩片離心機，1 200 r/min，離心3 min，取出細胞載玻片，利用吉姆薩染液覆蓋細胞涂片，染色2 min，之后應用清水沖洗掉粉紅色背景染色，放置于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.6劃痕實驗利用上述細胞培養技術及細胞計數方法，取對數生長期血管內皮細胞配制單細胞懸液，調整細胞個數為每孔1.5×105個，接種于12孔板，待細胞貼壁，生長成單細胞層時，用200 μl槍頭于板孔底面中軸劃一道劃痕，同時進行劃痕部位拍攝，設空白對照組及實驗組，每組4個復孔，常規培養24 h。以劃痕剩余面積測定LBP對HUVECs遷移能力影響。

1.7血管生成實驗于實驗前一天，將Matrigel基質膠(BD公司)放于4℃融化。滅菌100 μl槍頭及96孔板冷藏備用。開始實驗時，由冰箱中取出冷藏好的100 μl槍頭及96孔板，首先分組，設空白對照組及實驗組，每組4個復孔，目的為減少實驗誤差，然后將Matrigel基質膠加入96孔板(空白對照組及實驗組)中，每孔50 μl，共8孔。在加入基質膠時應注意保持槍頭垂直于孔板中間位置，其中Matrigel基質膠應一直保持放在冰上，避免凝固。鋪膠完畢后，將含有Matrigel基質膠的96孔板放入37℃孵育中孵育30 min，使基質膠凝固。在此過程中，開始準備HUVECs懸液，通過利用上述細胞培養技術及細胞計數方法配置HUVECs單細胞懸液，并調整細胞濃度為2×106/ml。空白對照組為含10%胎牛血清DMEM高糖單細胞溶液，對照組為含LBP 200 μg/ml單細胞溶液，細胞密度相同，均為2×106/ml。從孵育箱中取出96孔板，可見基質膠凝固完好，無氣泡產生，隨后將實驗組細胞懸液及空白對照組細胞懸液分別加入96孔板中，每孔100 μl，含HUVECs 20 000個。隨后將96孔板放入37℃體積分數為5%CO2孵育箱中培養，每隔6 h記錄實驗結果，最終取24 h血管形成圖片。

1.8實驗溶液配置①配置LBP母液。首先利用電子天平取35%含量LBP 10 mg，稱量精確到小數點后兩位，將稱取的紅褐色LBP粉末輕倒入15 ml離心管中，隨后加入10 ml D-PBS稀釋，使LBP粉末充分溶解，置于離心機中，500 r/min，后于超凈臺下應用0.22 μm微孔濾菌膜濾過沉淀物質及細菌，此時母液含量為1 μg/ml，母液配置完成。配置LBP實驗溶液，以500 μg/ml濃度為例，首先應用1 ml移液槍抽取母液1 ml置于2 ml Eppendorf管中，按1∶1加入10%胎牛血清DMEM高糖溶液1 ml，反復震蕩混勻，做好標記后存放于4℃冰箱。20，50，100，200 μg/ml濃度依次按上述方法成比例配置。②配取MTT溶液。利用電子天平稱取50 mg MTT，稱量精確到小數點后兩位，置于15 ml離心管中，加入D-PBS 10 ml,使其溶解，反復震蕩混勻，后于超凈臺內應用0.22 μm微孔濾膜除菌，分裝凍存于-20℃冰箱中貯存。③實驗細胞培養。取處于對數生長期的HUVECs，利用上述細胞培養技術及細胞計數方法，配置單細胞懸液，調整細胞濃度為4×104/ml，接種于96孔培養板中，每孔100 μl(約含HUVECs 4 000個)，四周邊孔應用D-PBS隔離，每孔100 μl，從而減少細胞趨向運動。放37℃體積分數為5%CO2孵育箱中常規培養6～9 h，使細胞完全附壁同步，備用。

1.9MTT法測定細胞吸光度值觀察細胞貼壁良好后，將各實驗組如前分組所示加入含不同濃度LBP培養基，空白對照組利用含10%胎牛血清DMEM高糖培養基代替。繼續放入孵育箱中培養24 h，然后每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h，然后吸棄各孔中上清液，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩混勻，室溫放置10～15 min，使結晶充分溶解混勻，于全自動酶標儀570 nm測定各組吸光度值。

1.10統計學方法采用SPSS17.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2結果

2.1各組MTT檢測結果見圖1。與A組(1.488±0.051)比較，C、D、E、F組對HUVECs生長抑制作用逐漸增強，吸收值分別為1.334±0.048、1.040±0.068、0.765±0.051、0.479±0.052(P<0.01)，B組為1.490±0.015。依據半數致死量(LD50)，現選取200 μg/ml作為實驗濃度。

圖1　MTT 法測定各組吸光度值(×100)

2.2各組相對剩余面積比較實驗組與空白對照組相對剩余面積具有統計學差異(P<0.05)，見表2，圖2。實驗濃度LBP可抑制新生血管形成，見圖3。

2.3細胞甩片技術大部分細胞萎縮、碎裂，部分細胞內可見凋亡小體形成，見圖4。由此推斷LBP很可能是通過促進細胞凋亡，縮短細胞生存周期而達到抑制血管內皮細胞生長作用。

圖2　各組各時間點(×100)遷移面積

圖3　各組24 h血管形成情況

組別0h(μm2)24h(μm2)相對比(%)空白對照組42.26±1.4813.45±1.2868.22±2.07實驗組43.19±1.0325.65±1.5640.63±2.811)

與空白對照組比較：1)P<0.05

圖4　HUVECs經實驗濃度LBP作用后細胞內部結構變化(×200)

3討論

中藥多糖對于臨床疾病的治療與預防有著新的領域及影響，具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血脂、保肝等多種功能,其中中藥多糖的免疫調節活性及抗腫瘤作用倍受關注〔1〕,抗腫瘤作用的活性成分已成為目前抗腫瘤研究的熱點〔2〕。到目前為止，已發現100多種中藥中的多糖化合物具有免疫促進作用〔3〕。LBP為其中之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等六種單糖組成〔4〕，具有提高機體免疫能力，抑制腫瘤細胞長，提高機體免疫力，增強機體內免疫細胞活性及其數量的作用〔5〕。目前LBP能夠提高免疫力，增強免疫細胞殺傷能力已得到大量研究的證實，相關文獻表明，LBP可與樹突細胞(DC)表面存在的多糖受體結合〔6〕,活化的DC及其釋放的活性因子可間接作用T細胞，使其活性功能提高〔7〕，使T細胞轉變為殺傷型T細胞，從而提高T細胞殺傷能力〔8〕；通過上調HL-60細胞表面MICA的表達，能增強自然殺傷(NK)細胞的殺傷活性〔9〕，且與濃度呈正比；單獨誘導淋巴細胞活化和增殖不明顯。而與PHA協同作用后可使淋巴細胞明顯增殖〔10〕；同時LBP還可直接作用于腫瘤細胞，通過直接破壞癌細胞的膜表面結構，使得腫瘤細胞無法進行正常的生命活動，降低腫瘤細胞膜的流動性〔11〕。

在腫瘤生長的微環境中不單純只有腫瘤細胞的存在，其中還有著大量的炎性細胞及基質細胞〔12〕，血管內皮細胞為其中之一，其主要功能為參與腫瘤血管的生成，而新生血管的形成則與腫瘤生長及遷移有著密不可分的聯系〔12〕。實體瘤的生長具有血管依賴性，當腫瘤間質血管生成后，腫瘤細胞會呈指數倍增長，轉移的機會也隨之增加〔13〕。本實驗表明，200 μg/ml LBP對HUVECs的增殖及遷移具有明顯的抑制作用，其機制很可能是縮短血管內皮細胞周期，促進其凋亡，從而達到抑制細胞增殖。同時血管內皮生長因子作為新生血管最為關鍵的刺激因子〔14〕，推測LBP能夠降低其血清中含量〔15〕，從而達到對HUVECs形成新生血管明顯的抑制作用。200 μg/ml LBP作用于機體正常基質細胞有無影響目前尚不明確，有待研究。

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〔2014-11-23修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1819-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.013

通訊作者：白光(1959-)，男，主任醫師，主要從事普外科微創肝膽病研究。

基金項目：吳階平醫學基金會臨床科研專項資助基金(No.320.6750.1281)；運動系統疾病轉化醫學研究中心及協同研究網絡建設項目(No.2013225305)

第一作者：尹遜天(1989-)，男，碩士在讀，主要從事肝膽疾病研究。