腎消通絡方對糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織病理形態結構的影響

馬國平　丁英鈞　董紹英　劉洪斌　趙玉庸

(河北醫科大學第一醫院心內科，河北　石家莊　050031)

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腎消通絡方對糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織病理形態結構的影響

馬國平丁英鈞1董紹英2劉洪斌3趙玉庸1

(河北醫科大學第一醫院心內科，河北石家莊050031)

〔摘要〕目的觀察腎消通絡方對糖尿病腎病(DN)大鼠腎功能及腎組織病理形態的影響。方法將實驗動物分為正常組、模型組、厄貝沙坦組及中藥組4組，中藥組按生藥20 g·kg-1·d-1進行干預。采用全自動生化分析儀測定生化指標：血糖(Glu)、24 h 微量白蛋白(24 h mAlb)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)；采用HE、PAS染色觀察腎臟病理改變；電鏡觀察腎小球超微結構的變化。結果腎消通絡方對DN大鼠血糖無明顯影響，具有一定的降脂作用；厄貝沙坦組、中藥組的24 h mAlb、Scr與BUN水平明顯低于模型組(P<0.05)；HE及PAS染色：厄貝沙坦組和中藥組較模型組病理改變減輕，兩組間差異不明顯。電鏡觀察：厄貝沙坦組和中藥組病理改變較模型組減輕。結論腎消通絡方可顯著降低DN大鼠24 h mAlb、Scr、BUN水平，減輕腎組織病理改變，具有改善腎功能、保護腎臟形態結構的作用。

〔關鍵詞〕腎消通絡方；糖尿病腎病；腎功能；病理改變

糖尿病腎病(DN)成為糖尿病(DM)的主要并發癥之一，并成為DM的主要死因。患者表現為漸進性腎功能損害，出現高血壓，水腫，蛋白尿等，并終致腎衰。“腎消通絡方”由黃芪、黃連、元參、地錦草、丹參、紅曲、金雀根、蟬蛻、地龍、烏梢蛇等組成，是對前期研究方劑“腎絡通”的進一步優化。本方基于DN的“熱傷氣陰，腎絡瘀阻”基本病機〔1,2〕，應用于臨床對DN有明顯療效，可改善腎功能并降低蛋白尿。本研究旨在探討腎消通絡方對DN的防治作用及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及用藥50只體重為(200±20)g的清潔級雄性SD大鼠，購自由河北醫科大學實驗動物中心。腎消通絡方各藥材購自國藥河北樂仁堂醫藥連鎖有限公司，每付藥物177 g，煎煮2次，混合2次煎出藥液，濃縮至約90 ml，約為含生藥2 g/ml。厄貝沙坦由賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產，調制濃度為2.5 mg/ml備用。

1.2主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司產品；RM2245型切片機，德國LEICA公司產品；SIM-F140AY65型制冰機，日本SANYO公司產品；BX53型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；日立H-7650型透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司產品。

1.3動物模型及分組正常組：50只大鼠適應性喂養1 w后，從中隨機抽取10只為正常組，剩余造模。以1次性腹腔注射1%STZ 50 mg/kg(空腹體重)制作DM模型，而正常組注射等量緩沖液。72 h后，空腹尾靜脈血糖高于16.7 mmol/L為DM造模成功。模型組、厄貝沙坦組、中藥組：33只成膜大鼠隨機分為以上3組，各11只。給藥與死亡情況：每日8:00灌服給藥，1次/d，共12 w。中藥組按生藥20 g·kg-1·d-1；厄貝沙坦組按25 mg·kg-1·d-1；模型組和正常組給予等量蒸餾水，自由飲食。實驗期間正常組無死亡；模型組3只死亡；厄貝沙坦組2只死亡；中藥組2只死亡。

1.4指標測定生化指標：血糖(Glu)、24 h 微量白蛋白(24 h mAlb)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)采用全自動生化分析儀按試劑盒要求測定。組織學檢查：取約1/4左腎組織入4%多聚甲醛溶液固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明10 min，浸蠟(63℃，1.5 h×2)，制成4 μm厚的切片，行HE、PAS染色。使用DP72-BX53數碼顯微鏡觀察腎臟病理學改變和Adobe photoshop 7.1軟件采集圖像。電鏡觀察：取腎組織入電鏡固定液，4℃保存，PBS洗3次，1%鋨酸固定2 h，去離子水洗5 min×3；梯度丙酮脫水，包埋，切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色。采用日立H-7650型透射電子顯微鏡，8 000～20 000倍率觀察、采集圖像。

1.5統計學處理應用SPSS13.0軟件行單因素方差分析及SNK檢驗。

2結果

2.1腎消通絡方對DN大鼠血糖血脂的影響Glu：模型組、厄貝沙坦組、中藥組的Glu明顯高于正常組(P<0.05)，但中藥組并無明顯降糖作用(P>0.05)。血脂：模型組、厄貝沙坦組、中藥組的TC水平明顯高于正常組(P<0.05)，模型組的TC明顯高于厄貝沙坦組及中藥組(P<0.05)，而厄貝沙坦組、中藥組之間的TC水平無顯著差異(P>0.05)。中藥組TG水平雖有下降趨勢，但各組之間TG水平并無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2腎消通絡方對DN大鼠腎功能的影響模型組、厄貝沙坦組、中藥組的24h mAlb、Scr與BUN水平明顯高于正常組(P<0.05)，且厄貝沙坦組、中藥組的24 h mAlb、Scr與BUN明顯低于模型組(P<0.05)，但厄貝沙坦組與中藥組之間并無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3腎消通絡方對DN大鼠腎組織病理形態的影響HE染色：正常組腎小球、腎小管形體結構基本正常。模型組腎臟病理改變明顯，腎小球基底膜明顯增厚，細胞外基質積聚，系膜細胞增生。厄貝沙坦組和中藥組較模型組病理改變減輕，兩組間差異不明顯。見圖1。PAS染色：正常組腎小球形態結構未見明顯異常，PAS陽性物質可見但不多。模型組可見明顯病理改變：腎小球基底膜增厚，且細胞外基質增多，并見系膜區明顯紅染。而中藥組與厄貝沙坦組亦可見病理改變，但較模型組輕，PAS陽性物質較少。見圖2。

2.4腎消通絡方對DN大鼠腎組織超微結構的影響電鏡觀察：正常組腎小球基底膜結構未見異常，未見增厚，足突結構正常。模型組可見明顯病理改變：腎小球基底膜廣泛增厚，足突融合與缺失多見，并見足細胞部分丟失，在部分節段十分明顯。而中藥組與厄貝沙坦組亦可見病理改變，但較模型組為輕，可見輕度腎小球基底膜增厚，出現較少足突融合。見圖3。

表1各組治療后大鼠生化指標的變化(x±s)

組別nGlu(mmol/L)24hmAlb(mg/24h)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常組105.3±0.840.10±0.0243.2±5.585.8±0.581.3±0.180.65±0.12模型組828.3±5.821)0.95±0.071)118.6±5.861)19.8±2.151)2.15±0.321)0.82±0.12厄貝沙坦組927.5±4.241)0.64±0.141)2)92.3±8.281)2)15.14±1.531)2)1.65±0.371)2)0.74±0.16中藥組926.4±6.001)0.60±0.091)2)93.8±7.021)2)15.18±1.981)2)1.78±0.221)2)0.68±0.14

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3討論

“熱傷氣陰，腎絡瘀阻”為DN基本病機，腎消通絡方基于此，并以“益氣養陰，清熱化瘀通絡”為治法組方而成。方中黃芪利水消腫，益氣健脾；元參滋陰清熱；黃連與地錦草清熱瀉火解毒并降糖作用；丹參、鬼箭羽與金雀根可活血化瘀，金雀根有免疫抑制、抗炎、降壓、降蛋白尿等作用；紅曲健脾化痰，活血化瘀，降脂；蟬蛻、地龍與烏梢蛇等藥化瘀通絡。采用多種蟲類藥是本方最大特點，蟲類入絡搜剔，有攻沖之性，善入細微孔隙，對于瘀血阻絡，正虛邪深之痼疾，其效尤著。腎消通絡方對DN大鼠血糖無明顯影響，具有一定的降脂作用。DM和DN患者的血液環境對腎臟有重要影響，高糖高脂可加速DN的發展。DM時高血糖狀態是DN的重要始動因素。在實驗大鼠中，正常組血糖水平正常且穩定，而模型組、厄貝沙坦組、中藥組血糖水平持續于高位。可能由于胰島β細胞的嚴重損傷，中藥組血糖水平下降不明顯，僅輕度減低。與文獻報道類似〔3〕，降壓藥物厄貝沙坦對DN具有保護作用，但其對血糖無顯著影響。實驗結果提示隨著DM時間延長，逐漸出現脂質代謝紊亂，血脂出現逐漸升高的趨勢。腎消通絡方可顯著降低DN大鼠24 h mAlb、Scr、BUN水平，從而改善腎功能。mAlb是檢測DM誘發腎小球微血管病變的有效早期指標，臨床上對于早期診斷DN十分重要，早期出現mAlb尿時的腎損傷一般是可逆的。本實驗顯示，腎消通絡方顯著降低了DN大鼠24 h尿 mAlb水平，與厄貝沙坦有類似作用，提示本方可逆轉DN早期腎損傷。Scr、BUN是檢測腎小球功能常用指標。本實驗提示腎消通絡方可明顯改善腎小球功能。腎消通絡方可以改善腎功能、延緩腎病進展，其臨床療效業已證實，而本研究通過對大鼠的24h mAlb、Scr、BUN的檢測數據為腎消通絡方的臨床療效提供了可靠的實驗依據。DN患者腎有諸多病理變化：腎小球和腎小管肥大，漸有基底膜增厚，系膜細胞增生，胞外基質積聚，終致腎纖維化。本研究首先以光鏡通過HE及PAS染色觀察腎組織形態結構，發現中藥組的腎小球、腎小管形態結構的病理變化比模型組減輕，類似于厄貝沙坦作用。并進一步以電鏡觀察腎小球的超微結構，發現中藥組與厄貝沙坦組腎病理改變亦較模型組減輕，腎小球基底膜增厚不明顯，足突融合較少。本研究從光鏡和電鏡兩個層面證實，類似于厄貝沙坦，腎消通絡方可減輕腎組織病理損傷，保護腎臟的基本形態結構。

4參考文獻

1丁英鈞,王世東,王穎輝,等.糖尿病“內熱傷陰耗氣”基本病機探討〔J〕.中醫雜志,2008;49(5):389-91.

2丁英鈞,蔡冀民,潘莉,等.慢性腎臟病“腎絡瘀阻”共有病機學說及臨床意義〔J〕.時珍國醫國藥,2011;22(3):690-1.

3李佃淳,聞海霞,叢艷,等.厄貝沙坦對實驗性糖尿病大鼠腎臟保護作用及對ICAM-1與VCAM-1表達的影響〔J〕.微循環學雜志,2009；19(1):13-6.

〔2014-10-18修回〕

(編輯趙慧玲)

〔中圖分類號〕R589

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1813-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.010

通訊作者：丁英鈞(1972-)，男，教授，博士，主要從事中西醫結合腎臟病研究。

基金項目：河北省自然科學基金(No.C2011206054);河北省中醫藥管理局科研計劃項目(No.2011001)

1河北中醫學院中西醫結合學院2石家莊市中醫院腎病科

3河北醫科大學

第一作者：馬國平(1972-)，女，副主任醫師，副教授，碩士，主要從事心內科疾病研究。