丹溪痛風方對阿爾茨海默病小鼠海馬的影響

張曉杰　費洪新　劉得水　張英博

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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丹溪痛風方對阿爾茨海默病小鼠海馬的影響

張曉杰費洪新劉得水張英博

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討丹溪痛風方(DGP)對阿爾茨海默病(AD)小鼠海馬的影響。方法C57BL/6小鼠隨機分成對照組，模型組，治療組(吡拉西坦0.42 g/kg)，DGP 高、中、低劑量組(DGP 52，26，13 g/kg)。采用小鼠雙側海馬微量注射(10 μg)β-淀粉樣蛋白1～42(Aβ1～422 g/L)和腹腔注射D-半乳糖(180 mg/kg)誘導AD小鼠。給予小鼠連續治療35 d后處死取材。采用Morris水迷宮測試小鼠學習記憶能力，觀察小鼠海馬結構，采用雙抗體夾心法測定海馬β-淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)、Aβ1～42、白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。結果與對照組比較，模型組小鼠海馬潛伏期和游泳距離明顯增加(P<0.05)，海馬目標停留時間和跨平臺次數明顯減少(P<0.05)，海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，DGP高、中劑量組AD小鼠海馬學習記憶能力明顯改善(P<0.05)，海馬神經元結構明顯改善，海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。結論DGP改善AD小鼠海馬學習記憶能力及海馬形態結構，通過抑制海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α在AD治療中發揮重要作用。

〔關鍵詞〕丹溪痛風方；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)是老年人認知障礙的常見原因之一。腦中β-淀粉樣蛋白(Aβ)增加，造成Aβ1～42沉積，形成老年斑(SP)，并對海馬神經元造成損傷。Aβ來源于β-淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)，通過激活神經膠質細胞促發神經性炎癥反應〔1〕。小膠質細胞(MG)活化分泌白介素(IL)-1β〔2〕，MG活化可被多奈哌齊抑制〔3〕。AD還表現為腦星形膠質細胞活化，伴有IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α增加〔4～10〕。

丹溪痛風方(DGP)是朱丹溪首先創立的古老方劑，組成包括天南星、蒼術、黃柏等，通過抗炎作用治療急性痛風性關節炎(AGA)和痛風性腎病等〔11～14〕。但DGP抗AD的研究尚屬于空白。本實驗擬探尋DGP對AD小鼠海馬的影響及其相關機制。

1材料與方法

1.1動物清潔級雄性8周齡C57BL/6小鼠，體重(23±2)g，48只，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心李寶龍副主任購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。小鼠飼養在常溫、常濕的實驗環境中，給予小鼠無菌飼料和蒸餾水。

1.2主要藥物和儀器藥物：吡拉西坦(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號5140556)，DGP(黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院周忠光教授購買，包括天南星、蒼術、黃柏、川芎、澤瀉、車前子、桃仁、威靈仙、羌活、防己、桂枝、紅花、土茯苓，批號分別為1306047、1310074、1401016、1312144、1401045、1406017、1310087、1310045、1401057、1312139、1312093、1401103、1407002，由田明教授制備成水煎劑，給藥時用生理鹽水溶解)，APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20140401)，Aβ1～42和D-半乳糖(Sigma公司)，其他試劑均為國產分析純，由黑龍江中醫藥大學周忠光教授提供。儀器：TCNAI-G2型透射電子顯微鏡(荷蘭公司)，ZH-DSG型Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)，TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，Leica-2135切片機(德國Leica公司)，STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)，6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)，HMIAS型高清晰度彩色醫學圖文分析系統(武漢千屏影像技術有限公司)，PLZOZ-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)等。

1.3方法

1.3.1AD模型復制C57BL/6小鼠水合氯醛麻醉后，剪去頭頂部毛發，固定小鼠，STW-1型腦立體定位儀定位小鼠海馬區，微量加樣器雙側腦室海馬區連續注入10 μg的Aβ1～42(2 g/L)，針頭留置15 min，緩慢退針，封閉，包扎小鼠，傷口處滴加青霉素，同時C57BL/6小鼠腹腔注射D-半乳糖(180 mg/kg)；對照組雙側腦室和腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2分組和給藥C57BL/6小鼠隨機分為對照組，模型組，治療組，DGP高、中、低劑量組，每組8只。DGP全方：蒼術15 g、黃柏15 g、防己15 g、威靈仙15 g、天南星15 g、澤瀉15 g、車前子15 g、川芎10 g、桃仁10 g、紅花10 g、羌活20 g、桂枝20 g、土茯苓25 g，共200 g。依據人和小鼠的體表面積比值計算給藥量。對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，治療組給予吡拉西坦0.42 g/kg灌胃，DGP高、中、低劑量組分別給予DGP 52、26、13 g/kg灌胃，灌胃給藥35 d。

1.3.3檢測AD小鼠Morris水迷宮潛伏期及游泳距離、目標停留時間、跨平臺次數采用ZH-DSG型Morris水迷宮檢測小鼠潛伏期。該儀器水深20 cm，高于平臺1 cm，水溫控制在(23±2)℃，水池內放置清潔自來水及奶粉，平臺放于第Ⅳ象限，第1、2、3、4天為訓練時間，每次訓練60 s。60 s內未找到平臺，需要將小鼠放在平臺上10 s。第5天為測試時間，觀察小鼠到達平臺位置的潛伏期，以此評價小鼠的學習能力。撤去平臺，記錄在60 s內小鼠找到平臺的游泳距離，以此來評價小鼠的記憶能力。然后檢測在60 s內小鼠在平臺所在象限的游泳時間(目標停留時間)和跨越平臺所在位置的次數(跨平臺次數)，以此評價小鼠學習記憶保持能力。

1.3.4檢測AD小鼠海馬CA3區電鏡結構Morris水迷宮實驗結束后，心臟灌注70 ml生理鹽水，2.5%戊二醛灌注，取材小鼠腦海馬CA3區，2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等，TCNAI-G2型透射電子顯微鏡觀察AD小鼠海馬CA3區結構。

1.3.5檢測AD小鼠海馬CA3區光鏡結構Morris水迷宮實驗結束后，常規制備石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，水洗，蘇木精染10 min，沖洗，鹽酸乙醇分化，水洗，氨水處理，水洗，伊紅染色，水洗，乙醇脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡觀察海馬組織CA3區結構。

1.3.6檢測AD小鼠海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α含量Morris水迷宮實驗結束后小鼠斷頭，取小鼠腦海馬，勻漿，靜置，5 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80℃保存。在6100型RT-雷杜酶標儀上450 nm波長處測定吸光度(A)，繪制標準曲線，求得小鼠腦海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α含量。

1.4統計學方法應用SPSS19.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析。

2結果

2.1DGP對AD小鼠Morris水迷宮潛伏期的影響經過4 d訓練，各組小鼠潛伏期呈整體下降趨勢。第5天與對照組比較，模型組小鼠潛伏期延長，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組、DGP高、中劑量組小鼠潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2DGP對AD小鼠Morris水迷宮游泳距離的影響經過4 d訓練，各組小鼠游泳距離呈整體下降趨勢。第5天與對照組比較，模型組小鼠游泳距離明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組、DGP高、中劑量組小鼠游泳距離明顯減少(P<0.05)。見表2。

2.3DGP對AD小鼠目標停留時間和跨平臺次數的影響與對照組比較，模型組小鼠目標停留時間明顯縮短和跨平臺次數明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，治療組、DGP高、中劑量組小鼠目標停留時間明顯延長和跨平臺次數明顯增加(P<0.05)。見表3。

2.4DGP對AD小鼠Morris水迷宮CA3區神經元電鏡結構的影響對照組小鼠海馬CA3區神經元形態規則，圓形，細胞核大而圓，核仁清晰，細胞質豐富，神經元形態正常；模型組小鼠海馬CA3區神經元形態不規則，神經元較小，細胞核橢圓形，細胞核萎縮，細胞質不豐富，細胞器較少；治療組，DGP高、中劑量組小鼠海馬CA3區神經元形態規則，神經元較大，細胞核大而橢圓，核仁清晰，神經元細胞質不同程度地增加，說明神經元功能不同程度地恢復；DGP低劑量組小鼠海馬CA3區神經元結構與模型組比較接近。見圖1。

表1DGP對AD小鼠Morris水迷宮潛伏期的影響(x±s，n=8，s)

組別劑量(g/kg)1d2d3d4d5d對照組-57.6±1.450.2±5.940.5±4.329.2±6.822.3±3.9模型組-58.2±1.356.9±2.449.0±3.442.3±3.937.9±6.61)治療組0.4258.1±1.151.5±5.239.0±4.231.5±6.723.5±5.62)DGP5257.7±1.152.0±5.241.6±4.329.4±6.225.2±5.22)2657.5±2.151.2±4.839.5±5.333.9±6.927.1±4.42)1358.0±1.850.7±4.947.0±3.038.5±7.135.6±5.9

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2DGP對AD小鼠Morris水迷宮游泳距離的影響(x±s，n=8，cm)

組別劑量(g/kg)1d2d3d4d5d對照組-1219.7±75.61091.8±141.6870.0±89.0670.2±88.8507.6±104.2模型組-1241.3±93.21203.6±130.11155.4±75.7902.8±133.7825.9±151.71)治療組0.421270.4±77.01145.2±149.2875.0±98.4711.2±132.7603.6±106.62)DGP組521236.8±82.11152.7±143.81014.9±153.2714.2±98.4609.8±108.52)261226.9±67.51110.4±133.51027.2±156.7763.7±62.7683.4±118.32)131257.0±88.61197.5±132.61116.2±190.1800.3±74.8751.9±101.2

2.5DGP對AD小鼠海馬CA3區神經元細胞質電鏡結構的影響對照組小鼠海馬CA3區神經元細胞質豐富，粗面內質網較多，雙層核膜清晰可見；模型組小鼠海馬CA3區神經元細胞質不豐富，核膜不清晰，細胞器較少；經過DGP治療后，治療組，DGP高、中、低劑量組小鼠海馬CA3區神經元細胞質不同程度地增加，核膜較清晰。見圖2。

2.6DGP對AD小鼠海馬CA3區神經元光鏡結構的影響對照組小鼠海馬CA3區神經元分布均勻，細胞4～5層，神經元形態正常，模型組小鼠海馬CA3區神經元2～3層，細胞分散排列，細胞質較少；治療組、DGP高、中劑量組小鼠海馬CA3區神經元層數較多，細胞質較多；DGP低劑量組小鼠海馬CA3區神經元形態比較清晰，排列較規則。見圖3。

2.7DGP對AD小鼠海馬APP和Aβ1～42的影響與對照組比較，模型組小鼠海馬APP和Aβ1～42明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組，DGP高、中劑量組小鼠海馬APP和Aβ1～42明顯降低(P<0.05)。見表4。

2.8DGP對AD小鼠海馬IL-1β和TNF-α的影響與對照組比較，模型組小鼠海馬IL-1β和TNF-α明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組DGP、高、中劑量組小鼠海馬IL-1β和TNF-α明顯降低(P<0.05)。見表5。

A：對照組；B：模型組；C：治療組；D：DGP高劑量組；E：DGP中劑量組;F：DGP低劑量組；下圖同圖1　DGP對AD小鼠海馬神經元電鏡結構的影響(透射電鏡，×2 550)

圖2　DGP對AD小鼠海馬神經元細胞質電鏡結構的影響(透射電鏡，×16 500)

表3DGP對AD小鼠Morris水迷宮目標停留時間和跨平臺次數的影響(x±s，n=8)

組別劑量(g/kg)目標停留時間(s)跨平臺次數(次)對照組-25.1±4.64.6±1.6模型組-13.7±3.21)2.4±0.91)治療組0.4223.2±4.82)4.4±2.02)DGP組5221.5±5.42)4.1±1.92)2619.8±4.92)4.0±1.92)1314.9±4.02.3±1.0

表4DGP對AD小鼠海馬APP和Aβ1～42的影響(x±s，n=8,ng/L)

組別劑量(g/kg)APPAβ1～42對照組-249.4±55.8129.0±49.7模型組-398.1±52.71)224.2±61.61)治療組0.42289.0±24.42)132.9±42.922)DGP組52291.6±59.32)149.9±59.32) 26290.9±72.82)152.9±39.22) 13368.7±66.1197.2±56.4

圖3　DGP對AD小鼠海馬神經元光鏡結構的影響(HE，×400)

表5DGP對AD小鼠海馬IL-1β和TNF-α的影響(x±s，n=8,pg/ml)

組別劑量(g/kg)IL-1βTNF-α對照組-240.3±88.5968.2±286.7模型組-384.2±94.81)1566.2±280.51)治療組0.42252.2±92.72)1107.5±323.42)DGP組52257.2±66.22)1208.3±226.92)26268.6±79.12)1249.5±308.72)13316.2±113.61398.0±224.2

3討論

AD是老年人高發的疾病之一，主要表現為學習記憶能力減退，腦淀粉樣物質沉積及大量炎癥介質釋放。AD病理改變主要集中在海馬、皮質等〔15〕，海馬可分為CA1區、CA2區、CA3區和DG區，其中CA3區與學習記憶關聯較大〔16〕。

Morris水迷宮檢測結果顯示，模型組小鼠學習記憶能力減退，模型穩定；DGP高、中劑量可改善AD小鼠學習記憶能力。透射電鏡和光學顯微鏡觀察可見，對照組小鼠海馬CA3區神經元基本結構正常，神經元未出現病變；小鼠海馬注射Aβ1～42造成海馬結構異常，神經元損傷，模型建立成功，可進行實驗研究；經過DGP治療后，海馬神經元結構得到不同程度地恢復。綜合說明DGP可改善AD小鼠海馬CA3區電鏡結構，提示DGP對AD小鼠有一定療效和實用價值。正常機體腦海馬內存在APP和Aβ1～42，但是機體不會發病。AD腦海馬存在大量APP，APP可形成Aβ1～42，Aβ1～42激活MG，活化MG分泌IL-1β，IL-1β作用方式包括自分泌和旁分泌。其中IL-1β作用于MG自身，促進MG增殖，釋放更多IL-1β；另外，IL-1β可作用于星形膠質細胞IL-1β受體，促進星形膠質細胞產生TNF-α等炎癥介質，形成神經性炎癥反應。實驗中模型組海馬炎癥介質及其形成老年斑的原材料增加，海馬無菌性炎癥反應明顯；經過DGP治療后，DGP高、中劑量組海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α降低，說明DGP高、中劑量改善腦海馬神經性炎癥反應。本實驗顯示海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α變化趨勢與改善AD小鼠海馬CA3區結構及其學習記憶能力相關聯，小鼠海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α降低伴隨著小鼠海馬CA3區結構及其學習記憶能力改善，提示DGP可通過降低小鼠海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α來改善小鼠學習記憶能力和海馬結構，也提示海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α是防治AD的重要評價指標。

4參考文獻

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〔2015-12-25修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of Danxi Gout Party on hippocampal in Alzheimer's disease mice

ZHANG Xiao-Jie，FEI Hong-Xin，LIU De-Shui，et al.

Qiqihar Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Danxi Gout Party(DGP) on hippocampal in Alzheimer's disease(AD) mice.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into control，model，treatment(Piracetam 0.42 g/kg)，DGP high-dose(DGP 52 g/kg)，DGP medial-dose(DGP 26 g/kg),DGP low-dose groups(DGP 13 g/kg).By using microinjection of 10 μg incubated amyloid beta1～42(Aβ1～422 g/L) into the dorsal blade of the dentate gyrus in the bilateral hippocampus with intraperitoneal injection of D-galactose(180 mg/kg) in combination of mice to induce an AD mice.The mice were killed after 35 days continuous treating.After the treatment all animals were sacrificed.The Morris water maze was used to observe the learning and memory ability for the mice.Electron microscopy of hippocampus was observed.Biochemical methods were used to determine the content of β-amyloid protein precursor (APP)，Aβ1～42，interleukin(IL)-1β and tumor necrosis factor(TNF)-α in the hippocampus tissue.ResultsCompared with the control group，latencies and swimming distances were significantly increased(P<0.05);target quadrant time and the number of cross-platform were significantly decreased(P<0.05);APP，Aβ1～42，IL-1β and TNF-α were significantly increased in model group(P<0.05).Compared with the model group，high-and medial-dose of DGP could significantly improve the learning,memory ability and morphological structure of hippocampus tissue of AD mice(P<0.05),APP，Aβ1～42，IL-1β and TNF-α in the hippocampus tissue were significantly decreased in high-and medial-dose of DGP groups(P<0.05).ConclusionsDGP could improve the ability of learning,memory and morphological structure of the hippocampus tissue of AD mice.DGP plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting APP，Aβ1～42，IL-1β and TNF-α.

【Key words】Danxi Gout Party；Alzheimer's disease

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1798-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.004

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81173576，81373777，81173599)；黑龍江省自然科學基金資助項目(p01354)；黑龍江省教育廳資助項目(12521624，12531788，12531790)

第一作者：張曉杰(1965-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事癡呆、腫瘤、抑郁、痛風研究。