紅景天苷上調HIF-1信號途徑并減輕腦缺血再灌注損傷的研究

武警陜西省總隊醫院麻醉科(西安710054)　王　軍　曹　艷　常　江

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紅景天苷上調HIF-1信號途徑并減輕腦缺血再灌注損傷的研究

武警陜西省總隊醫院麻醉科(西安710054)王軍曹艷常江

摘要目的：探討紅景天苷對大鼠腦缺血再灌注的保護作用及其分子機制。方法：SD大鼠隨機分為4組：正常對照組、正常對照+紅景天苷組、腦缺血再灌注組、腦缺血再灌注+紅景天苷組。紅景天苷處理組運用紅景天苷(40 mg/kg)處理2周，腦缺血再灌注采用局灶性腦缺血1 h，隨后再灌注24 h處理，隨后取腦，測定腦缺血體積、檢測MDA和8-OHdG等應激產物，提取mRNA用于定量RT-PCR測定基因表達水平變化。結果：正常對照+紅景天苷組大鼠的腦組織中HIF-1a、乳酸脫氫酶(LDH)和己糖激酶(HK)等表達水平顯著升高。腦缺血再灌注可誘導HIF-1a、LDH和HK的表達，紅景天苷處理組行腦缺血再灌注后HIF-1a、LDH、HK升高程度較腦缺血再灌注組顯著減弱。結論：紅景天苷處理可誘導腦組織中HIF-1的表達，增加糖酵解酶的水平，加強腦組織對缺血再灌注損傷的抵抗。

主題詞腦再灌注損傷紅景天苷缺氧誘導因子1乳酸脫氫酶類己糖激酶

腦缺血再灌注損傷是臨床腦缺血病治療中的一個難題，其主要病因是缺血再灌注之后發生嚴重的氧化應激，導致神經損傷。預防腦缺血再灌注的藥物研究一直是人們關注的熱點，其中，紅景天因其抗高原缺氧的療效而備受關注。紅景天是多年生草本植物，其主要成分紅景天苷具有抗疲勞、抗衰老、消除自由基等多種藥理作用[1]。有報道指出，紅景天苷對心臟和大腦等器官的缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[2]。紅景天苷上述作用的分子機制仍有待進一步明確。低氧誘導因子-1(HIF-1)是低氧刺激表達的一個關鍵分子，可通過信號轉導通路誘導多個基因的表達，促進細胞適應低氧環境。在體外培養的心肌細胞，紅景天苷可誘導HIF-1的表達，并減少缺氧所致心肌細胞凋亡[3]。本研究在大鼠整體動物水平觀察了紅景天苷調節腦組織HIF-1表達的作用，并在缺血再灌注模型動物觀察了紅景天苷抗缺血再灌注損傷的作用，進而加深了對紅景天苷抗腦缺血再灌注的作用和分子機制的認識。

材料和方法

1材料80只健康成年雄性SD大鼠，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。HIF-1、乳酸脫氫酶(LDH)、己糖激酶(HK)的引物由Life Technologies公司合成。實驗常用試劑均為國產分析純試劑。

2動物分組和處理動物隨機分為正常對照組(C組)、正常+紅景天苷組(S組)、缺血再灌注組(IR組)，缺血再灌注+紅景天苷組(IR+S組)，每組20只。S組靜脈注射紅景天苷[40 mg/(kg·d)]，給藥14 d。IR+S組在注射紅景天苷[40 mg/(kg·d)]14 d后行腦缺血再灌注。IR組注射生理鹽水作為對照14 d后行腦缺血再灌注。腦缺血再灌注大鼠模型制備參照Longa等方法[4]。大鼠經水合氯醛麻醉后，仰臥固定，頸正中切口分離右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在頸外動脈分叉處結扎頸總動脈，近心端結扎頸外動脈，頸內與頸外動脈交叉處剪一小口，插入處理后的尼龍線，遇阻力停止，1 h后拔出尼龍線，進行再灌注。隨后縫合手術切口，待大鼠麻醉清醒后單籠喂養，24 h后進行檢測。

3腦梗死體積測定每組取出6只大鼠，麻醉后迅速取腦，冰鹽水冷卻后，1 mm厚度連續做腦組織冠狀切片，放入2%TTC溶液中于37℃孵育30 min，再用10%甲醛固定，隨后組織切片照相，用圖像分析軟件計算梗死面積，各片的梗死面積之和乘以腦片厚度，得出腦梗死體積。

4氧化應激檢測每組6只大鼠麻醉后，迅速取腦，選取腦梗死區域組織，制備腦組織勻漿，勻漿液經低溫離心后取上清用于丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平檢測。MDA和8-OHdG檢測采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行，操作步驟按照試劑盒使用說明書進行。上清中蛋白水平采用BCA蛋白定量方法進行。

5基因表達檢測每組8只大鼠麻醉后，迅速取腦，選取腦梗死區域組織，用RNA提取試劑盒提取RNA進行反轉錄，隨后應用定量PCR方法進行檢測。所用引物的序列如下：HIF-1a的上游引物是5’-ACA GTT ACA GGA TTC CAG CAG AC-3’，下游引物是5’-GAT TCA TCA GTG GTG GCA GTT G-3’。LDH的上游引物是5’-GCA GCA GGG TTT CTA TGG AG-3’，下游引物是5’-TGG AGA CAG TGG GAT TGT CA-3’。HK的上游引物是5’-CAT GAG GAA GAT GCT TGC CG-3’，下游引物是5’-CTA CCA GCA CTC TGC TTG CC-3’。 內對照18S的上游引物是5’-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3’，下游引物是5’-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3’。 采用Delta-delta Ct法對基因表達水平差異進行分析。

6統計學方法數據采用均數±標準差表示，用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。方差分析對各組間差異性進行比較，以P<0.05為有顯著性差異。

結果

1紅景天苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的減輕作用見表1。C組和S組大鼠未見明顯腦梗死，與之相比，IR組和IR+S組大鼠在腦缺血再灌注后均出現程度的腦梗死，梗死體積在IR+S組較IR組顯著減小(P<0.01)。腦組織MDA和8-OHdG檢測結果顯示，IR組和IR+S組的大鼠的腦組織中MDA和8-OHdG水平均較C組和S組顯著升高(P<0.01)。與IR組相比，IR+S組大鼠腦組織中MDA和8-OHdG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1　紅景天苷對大鼠腦梗死體積、腦組織

注：與 C組和S組比較，aP<0.01；與IR組比較bP<0.05

2紅景天苷對大鼠腦組織HIF-1、LDH和己糖激酶的表達檢測見表2。與C組相比，S組中HIF-1、LDH和己糖激酶的基因逼到顯著升高(P<0.01，n=8)。IR組大鼠的腦組織中HIF-1、LDH和己糖激酶的表達較C組也顯著提高(P<0.05，n=8)。IR+S組大鼠腦組織中HIF-1、LDH和己糖激酶的表達較S組升高(P<0.05，n=8)，但是其升高程度較IR組無顯著性差異。

表2　紅景天苷對大鼠腦組織中HIF-1a、

注：與 C組和S組比較，*P<0.01；與IR組比較△P<0.05

討論

本研究發現紅景天苷處理后神經功能損傷的積分下降，腦梗死體積減小，表明紅景天苷可減輕腦缺血再灌注損傷。宋斌等[5]報道紅景天苷減輕心臟的缺血再灌注損傷，其中抗氧化應激可能是其保護作用的一個原因。陳秀娟等[6]也觀察到紅景天苷對大鼠腦缺血再灌注的保護作用。本研究則進一步說明紅景天苷可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，并指出紅景天苷的作用與抗氧化應激有關。

MDA和8-OHdG分別是脂質過氧化和 DNA氧化損傷的標記物，其水平可反映機體氧化應激程度。MDA和8-OHdG升高表明缺血再灌注誘導誘導氧化應激的發生。本研究發現缺血再灌注誘導大鼠腦組織中MDA和8-OHdG升高，這與以往報道腦缺血再灌注損傷伴有顯著的氧化應激相一致[7]。氧化應激被認為是腦缺血再灌注損傷的一個重要原因。有文獻表明，紅景天苷可減少氧化應激產物的生成[8]。本研究證實，紅景天苷處理組進行缺血再灌注時大鼠腦組織中MDA和8-OHdG升高程度顯著下降，說明紅景天苷可減弱大鼠腦組織的氧化應激反應，從而起到腦保護作用。

本研究進一步發現紅景天苷抗缺血再灌注損傷的作用可能與其上調HIF-1基因及其相關基因的表達有關。HIF-1a是低氧誘導表達的一個關鍵分子，在缺氧適應等方面發揮重要作用。HIF-1可誘導糖代謝相關酶如乳酸脫氫酶和己糖激酶等的表達，從而提高組織在缺氧條件下的能量利用[9]。張金平等[10]指出，紅景天苷可通過PI(3)K/Akt激活離體培養心肌細胞HIF-1α表達并抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡，這提示HIF-1a是紅景天苷的一個靶分子。本研究發現，紅景天苷可在整體情況下上調腦組織中HIF-1a的表達，這進一步支持HIF-1a是紅景天苷激活的靶分子。紅景天苷還上調腦組織乳酸脫氫酶和己糖激酶的表達，這兩個HIF-1a的下游分子的激活進一步支持紅景天苷上調HIF-1a表達的作用。乳酸脫氫酶和己糖激酶表達增強可提高組織對缺氧的抵抗力，這很可能是紅景天苷抗大鼠腦缺血再灌注損傷的主要原因。腦缺血再灌注誘導HIF-1a表達，這是組織的一個適應性反應。腦缺血再灌注誘導HIF-1a表達的程度在紅景天苷處理組較對照組并沒有進一步的升高，這也提示紅景天苷處理誘導HIF-1a表達后可產生一定的保護作用，使組織發生損傷較輕，HIF-1a等損傷刺激性表達的程度相對減小。

總之，我們的研究證實紅景天苷具有抗腦缺血再灌注損傷的作用，并提出上調HIF-1a表達是紅景天苷上述作用的可能的分子機制。這為臨床應用紅景天苷防治腦缺血再灌注損傷提供了依據。

參考文獻

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(收稿：2015-07-03)

The effects of salidroside on expression of HIF-1 and attenuation of cerebral ischemia-reperfusion injury

Shaanxi Provincial Corps Hospital Chinese People’s Armed Police

Forces Department of Anesthesiology(Xi’an 710054)WangJunCao Yan ChangJiang

ABSTRACTObjective：To confirm the protective effects of salidroside on cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury and explore its molecular mechanism. Methods：SD rats were randomly divided into four groups：normal control， normal rats+salidroside， I/R group， I/R +salidroside. Rats in groups with salidroside treatment were given salidroside (40 mg/kg) for two weeks.I/R rats were treated by the thread ligation in internal carotid artery. In the end of treatment， the brain of each rat was collected.The infarct sizes，the levels of malondialdehyde (MDA) and 8-dydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) in brain tissues，and the expression of HIF-1a， lactate dehydrogenase (LDH) and hexokinase (HK) were observed. Results：Salidroside treatment of normal rats induced a significant increase in the expression of HIF-1a，LDH，HK as compared to normal control. I/R resulted in the increase in the expression of HIF-1a，LDH，HK as compared to normal control. Rats in I/R+salidroside group had a significantly weakened increase in expression of HIF-1a， LDH， HK as compared to I/R group.Infarct sizes were significantly smaller and levels of MAP and 8-OHdG were significantly lower in I/R+salidroside group than those in I/R group.Conclusion：Salidroside induces cerebral HIF-1a expression and increase enzyme levels for glucolysis， which showed protective effects against cerebral ischemia reperfusion injury.

KEY WORDSBrainReperfusion injuryRhodiolosideHypoxia-tnducible factor 1Lactate dehydrogenasesHexokinase

【中圖分類號】R743.32

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.011