槲寄生凝集素抗膽管癌的作用及機制研究

陜西省友誼醫院(西安710068)　高旭亮　王佐權　胡江波　詹俊宏

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槲寄生凝集素抗膽管癌的作用及機制研究

陜西省友誼醫院(西安710068)高旭亮王佐權▲胡江波詹俊宏

摘要目的：研究槲寄生凝集素是否具有抗膽管癌的作用并初步探討其作用機制。方法：體外培養膽管癌細胞ICC-9810，根據培養液中槲寄生凝集素濃度的不同，分為對照組、1ng/ml組、10ng/ml組、100ng/ml組。干預48 h后收集標本。MTT法檢測細胞活力，并計算腫瘤抑制率；流式細胞儀檢測凋亡細胞比率；Western-blot方法檢測Bcl-2蛋白表達情況。結果：干預48 h后，各實驗組OD值出現了降低，且隨給藥濃度的增加，OD值逐漸降低，腫瘤抑制率逐漸增高(P<0.05)；凋亡細胞比率也隨培養液中槲寄生凝集素濃度的增加逐漸升高(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達量也隨給藥濃度的增加而逐漸降低。結論：槲寄生凝集素能夠在體外抑制ICC-9810細胞的生長，并通過下調Bcl-2蛋白表達量而促進細胞的凋亡，而且這種作用隨槲寄生凝集素濃度的增加而加強。

主題詞膽管腫瘤槲寄生細胞遷移抑制細胞凋亡

槲寄生是一種古老的中藥，屬桑寄生科，被證明具有抑制肝癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞生長的作用[1-3]。但是，榭寄生是否同樣具有抗膽管細胞癌的作用，至今尚無研究表明。為了證明槲寄生同膽管癌的關系，我們進行了以下實驗，現報道如下。

材料與方法

1材料DMEM培養基購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；Hoechst染色液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、細胞質蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；槲寄生凝集素購自美國Sigma公司。人肝內膽管癌細胞系ICC-9810購自中國科學院細胞庫。

2細胞培養將ICC-9810培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM培養基中，37℃ 孵箱中培養，隔天傳代。

3分組及干預情況對照組：培養ICC-9810細胞，培養液中加入PBS作為對照； A組：培養液中加入槲寄生凝集素1 ng/ml；B組：培養液中加入槲寄生凝集素10 ng/ml；C組：培養液中加入槲寄生凝集素100 ng/ml；干預48 h后，收集細胞并進行檢測。

4MTT比色法檢測細胞增殖活性取對數生長期ICC-9810細胞，按每孔2.5×103個細胞接種于96孔培養板進行分組培養，每孔總反應體積為200μl。待細胞貼壁后換液并根據分組不同按上述方法給予干預，干預48 h后每孔加5 g/L的MTT 20μl，繼續培養4 h后，吸凈每孔中液體，再加入100 μl的二甲基亞砜，在37℃的水浴搖床上孵育10 min。待MTT結晶充分溶解后置酶標光度儀測定各孔在490 nm波長處吸光度的OD值。

5細胞抑制率計算依據MTT檢測結果，通過以下公式計算細胞抑制率：抑制率=(對照組-實驗組)/對照組×100%。

6Annexin/PI 法檢測細胞凋亡藥物干預48 h后，消化并收集細胞，4℃的PBS洗滌兩次，再用250μl結合緩沖液重懸，調節細胞濃度至1×106/ml。吸取細胞懸液100μl置于5 ml的流式管之中，并加入5μl的Annexin V/FITC和5 μl 20 μg/ml的碘化丙錠溶液；混勻后置于室溫避光孵育15 min；反應管中加入400 μl已稀釋好的結合緩沖液，用流式細胞儀檢測，488 nm的氬離子激光器作為光源，PI 發紅色熒光。

7Western-blot 檢測Bcl-2蛋白表達取對數生長期 ICC-9810細胞，將其接種于6孔板，調整細胞濃度為每孔1×105，12 h后分別應用不同濃度的槲寄生凝集素進行干預，48 h之后終止培養，并收集細胞提取蛋白，紫外吸收法測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白后轉膜，把轉上蛋白的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放于含有5%的脫脂奶粉Tris鹽緩沖液中封閉1h，再TBST 漂洗。分別加入抗人Bcl-2的一抗在4℃ 孵育過夜，之后TBST漂洗3次，每次10 min。加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1h后，漂洗充分，最后采用電化學發光法顯像，于暗室中X 射線曝光壓片，再顯影定影，最終得到目的蛋白條帶。 該過程重復3次，并選用β-αctin 作為內參。結果應用Image-pro Plus 6.0軟件進行灰度分析。各實驗組結果同對照組的灰度值進行比對，得出相對于對照組的倍數變化情況。

8統計學方法計量資料通過均數±標準差的方式表達，應用SPSS 18.0統計軟件進行分析。組間比較采用ANOVA的方法進行，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1MTT檢測結果及腫瘤抑制率對比干預48 h后，MTT法檢測ICC-9810細胞的OD值，對照組為0.765±0.098；A組為0.604±0.075；B組為0.413±0.051；C組為：0.233±0.034(圖1)。各組相比差異有統計學意義(P<0.05)。計算各實驗組的腫瘤抑制率，A組的腫瘤抑制率為：21.05%，B組為：46.01%；C組為：69.54%(圖1)。各組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1　各組MTT值及腫瘤抑制率比較

2槲寄生凝集素對細胞凋亡的影響正常狀態下培養ICC-9810細胞，發現僅有少量細胞處于凋亡狀態(7.9%±1.8%)。而培養液中加入槲寄生凝集素后，ICC-9810細胞的凋亡細胞比例出現升高，且凋亡細胞比例隨給藥濃度的增加呈升高趨勢。其中A組的凋亡細胞比例為：27.8%±3.96%，B組凋亡細胞比例為：47.3%±5.46%，C組凋亡細胞比例為：59.1%±6.38%(圖2)。各組間對比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2　流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況

3Bcl-2蛋白表達情況正常狀態下，ICC-9810細胞中Bcl-2呈高表達狀態，而給予槲寄生生物凝集素后，Bcl-2蛋白表達出現降低，且蛋白表達降低程度隨著給藥濃度的增加而呈現出遞減趨勢(圖3)。對比各組間灰度變化情況， A組較對照組灰度變化0.775±0.134倍，B組較對照組灰度變化0.469±0.068倍， C組灰度較對照組變化0.181±0.031倍(圖4)。對比各組間灰度變化情況，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖3　Bcl-2蛋白表達情況

圖4　較對照組各組Bcl-2倍數變化情況

討論

槲寄生是桑寄生科灌木植物的總稱，是一種半寄生的植物。中醫認為槲寄生有祛風濕，補肝、補腎、強健筋骨、安胎、養血等作用，被用于風濕痹痛，腰膝酸軟、胎動不安等癥狀的治療[4]。此外，槲寄生還被發現具有抗腫瘤作用[5]。其抗腫瘤活性成分包括多糖、植物凝集素、多酚、生物堿等，其中凝集素是表現槲寄生各生物活性的最重要成分，并被用作為抗腫瘤的一種輔助治療藥物[6-9]。英國衛生最近也已經通過將槲寄生提取物作為一種化療藥物應用于臨床中。現在市場上主要有Isorel、Helixor、Iscdor、Eurixor等多種槲寄生提取物制劑[9]。專家預測槲寄生也有望成為繼紫杉醇后又一種植物源抗癌藥物[9]。雖然近年來的研究不斷表明，槲寄生能夠抑制肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等的生長[1-3]，但其是否同樣能夠抑制膽管癌的進展，尚無研究表明。我們通過MTT這一簡便檢測細胞增殖活力的方法，發現應用槲寄生凝集素后，細胞活力明顯下降，而且隨著給藥濃度的增加進一步減低，其腫瘤抑制率也呈遞增趨勢。這說明槲寄生凝集素同樣能夠明顯抑制膽管癌細胞的增殖。但槲寄生凝集素抗究竟通過何種途徑抑制了膽管癌細胞的增殖，我們進一步對細胞的凋亡進行了檢測。

凋亡是細胞的一種程序性的死亡，與各種生理及病理刺激所引起的細胞死亡不同，凋亡在細胞形態上特征性表現為以細胞皺縮繼而細胞碎片形成，之后被吞噬細胞所清除[9]。而腫瘤凋亡細胞比例的增加，直接表現為腫瘤生長的抑制。我們通過流式細胞儀檢測發現，槲寄生凝集素能夠促進ICC-9810細胞的凋亡細胞比例增加，而且隨著槲寄生凝集素濃度的增加，凋亡細胞比例逐漸增加。

微觀層面而言，凋亡的核心是通過多種信號通路引起caspase介導的細胞內蛋白酶激活，其中線粒體途徑是引起細胞凋亡的最主要的途徑之一[10]。該途徑在激活過程中的關鍵是細胞色素C釋放到胞漿中，引起caspase 9激活從而啟動caspase級聯反應。而細胞色素C由線粒體的釋放則由Bcl-2所調節。當Bcl-2家族決定細胞將要死亡時，bax和bak形成聚合體進而穿透線粒體外膜導致細胞色素C及多種其他多種線粒體膜間隙蛋白的釋放[11]。在本研究中我們發現，槲寄生凝集素能夠下調Bcl-2蛋白的表達，且隨給藥濃度的增加其表達量也逐漸減低。這樣的結果說明槲寄生凝集素是通過下調Bcl-2蛋白的表達從而促進ICC-9810的凋亡。

綜上所述，槲寄生凝集素能夠在體外抑制ICC-9810細胞的增殖，并通過下調Bcl-2蛋白表達途徑而促進細胞的凋亡，而且這種作用隨槲寄生凝集素濃度的增加作用增強。

參考文獻

[1]曲義坤，丁隆，劉偉新，等.槲寄生生物堿抗胃癌的作用[J].中國老年學雜志，2013，33(1)：103-104.

[2]孫莉，姚俊濤，王一羽，等.槲寄生堿抑制肺癌細胞增殖作用初步觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，20 (21)：1653-1656.

[3]楊學良，任強，王廣義.重組槲寄生凝集素抗肝癌作用[J].中國老年學雜志，2015，32(5)：1348-1350.

[4]姚俊濤，王一羽，原榮，等.槲寄生堿抗胰腺癌作用的實驗研究[J].陜西中醫，2010，31(5)：621-623.

[5]陳慶亮，單成鋼，朱京斌，等.槲寄生生物學研究進展[J].安徽農業科學，2010，38(22)：11830-11831.

[6]Steele ML，Axtner J，Happe A，etal. Use and safety of intratumoral application of European mistletoe (Viscum album L) preparations in Oncology[J]. Integrative cancer therapies，2015，14 (2)：140-148.

[7]孔景臨，劉威，穆晞惠，等.槲寄生蛋白抗癌活性研究及新成分鑒定[J].醫學分子生物學雜志，2012，9 (1)：49-52.

[8]張水仙，劉越，孫洪波，等.槲寄生化學成分及藥理作用研究進展[J].中藥材，2011，34(12)：1962-1967.

[9]Muthu M，Cheriyan VT，Rishi AK.CARP-1/CCAR1A biphasic regulator of cancer cell growth and apoptosis[J].Oncotarget，2015，6(9)：6499-6510.

[10]Jiang L，Wang L，Chen L，etal. As2O3 induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells through a ROS-mediated mitochondrial pathway and activation of caspases[J]. International Journal of Clinical and Experimental Medicine，2015，8(2)：2190-2196.

[11]Correia C，Lee SH，Meng XW，etal.Emerging understanding of Bcl-2 biology：Implications for neoplastic progression and treatment[J].Biochimicaet ，2015，1853 (7)：1658-1671.

(收稿：2015-05-08)

【中圖分類號】R735.8

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.010