β-欖香烯對肺腺癌細胞增殖作用的影響*

西安交通大學醫學院附屬西安市中心醫院(西安 710003)

李建英△　魚　軍　苗　宇　王娟紅　杜旭升　王　波　張惠民　劉　安　王一理△▲

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β-欖香烯對肺腺癌細胞增殖作用的影響*

西安交通大學醫學院附屬西安市中心醫院(西安 710003)

李建英△魚軍苗宇王娟紅杜旭升王波張惠民劉安王一理△▲

摘要目的：探討β-欖香烯對肺腺癌細胞的抗腫瘤作用及其機制。方法：使用RT-PCR和Western blot法檢測β-欖香烯對腫瘤細胞中P53 mRNA和蛋白表達的影響；同時使用差速離心法提取外泌體，利用電鏡和Western blot 法進行分析。通過轉染P53 siRNA構建P53下調細胞株。對BABL/c裸鼠腫瘤模型皮下注射A549細胞，探索體內環境下β-欖香烯對腫瘤生長的影響。結果：①通過siRNA技術構建P53下調細胞株，觀察到β-欖香烯對A549細胞的作用依賴于P53的表達；②A549細胞源性的外泌體能夠抑制肺癌細胞的增殖；③體內實驗證實β-欖香烯通過上調P53表達和外泌體的釋放實現抑制腫瘤生長的作用。結論：β-欖香烯通過調控P53的表達和外泌體的釋放來影響肺癌細胞的增殖。

主題詞肺腫瘤 欖香烯 細胞增殖外泌體

欖香烯(1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙烯基環己烷)是一種從中草藥姜黃中分離出來的具有抗腫瘤作用的藥物，分為α-、β-以及γ-欖香烯3種。β-欖香烯作為主要的抗腫瘤成分，在體內外實驗中已被證明具有抗腫瘤作用并且其副作用少[1]，因此具有更好的前景。初步研究提示β-欖香烯通過引起G2-M期阻滯以及下調Bcl-2 和Bcl-xl實現細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的[2-3]。但目前β-欖香烯的抗腫瘤機制尚不清楚，β-欖香烯的抗腫瘤作用是否還存在其他調控途徑也不清楚。本研究中我們發現β-欖香烯能夠上調P53的表達，同時增加外泌體的釋放，從而闡明了P53在β-欖香烯抗肺癌細胞增殖及促進凋亡中的具體作用。

材料與方法

1材料人肺腺癌細胞A549和H460 購自ATCC；10%胎牛血清、RPMI 1640培養基、脂質體2000購自GIBCO公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技術公司；BALB/c雄性裸鼠購自西安交通大學實驗動物中心。

2細胞培養人肺腺癌細胞A549和H460 (ATCC，Rockville，MD)在含有10%胎牛血清(Gibco BRL， Gaithersburg， MD)、100 IU/ml青霉素以及100 g/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基(Gibco BRL， Gaithersburg， MD)中培養。細胞在37℃、含有5% CO2和 95% 空氣的培養箱中孵育。

3RT-PCR使用試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)在A549細胞中提取總RNA，之后將2 μg的總RNA加入反轉錄體系中，參照說明完成實時聚合酶鏈反應。引物序列：P53[4]：5’-ATTCTGGGACAGCCAAGCT-3’、5’-TAGTTGTAGTG-GATGGTGGTA-3’；GAPDH：5’-CAAGCTCATTTCCTGGTATGAC-3’、5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。GAPDH作為實驗的內參。相關基因的表達水平使用GAPDH mRNA和2-△△CT法進行計算。

4Western blot免疫印跡法用于檢測肺癌A549細胞P53和外泌體的表達水平。用RIPA裂解液(Beyotime， Nantong，China)在A549細胞中提取總蛋白及外泌體。將等量的蛋白質加入到12%的SDS-PAGE，之后用電泳的方法對蛋白進行分離。一抗為兔單克隆和多克隆抗體，HRP連接的羊抗兔抗體作為二抗。通過ELC顯色法將結合的抗體進行顯色。β-actin作為內參用于計算其他蛋白質的表達水平。所有實驗重復至少3次。

5外泌體分離用系列離心步驟對外泌體進行分離。將培養過細胞的培養基進行收集，在300×g環境下離心5 min，1200×g環境下離心15 min除去細胞碎片。棄去上層液體后在7000×g環境下離心50 min，用PBS洗滌后在100000×g環境下離心60 min。用PBS對沉淀進行重懸，在100 000×g環境下離心60 min。最后將PBS重懸收集到的外泌體，保存在-80℃環境中。用于電子顯微鏡觀察的外泌體保存在-4℃環境中。

6電鏡觀察對經過離心收集到的來源于A549細胞的外泌體加入EM網格中，再加入1%戊二醛。使用乙酸雙氧鈾和甲基纖維素的混合物進行背景染色。去除多余的液體后，80kV、JEOL 1200電子顯微鏡進行觀察并記錄。

7用siRNA技術沉默基因表達用脂質體2000作為轉染試劑，對A549細胞轉染P53 siRNA(siP53)或對照siRNA。P53 siRNA序列為5’-GATCCCCGACTCC-AGTGGTAATCTACT-TCAA

GAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTGGA

AA-3’和 5’-AG-CTTTTC-CAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATT-A

CCACTGG-AGTCGGG-3’[5]。

8體內實驗使用裸鼠皮下移植瘤進行體內實驗。于西安交通大學實驗動物中心購買BALB/c雄鼠，按規定進行飼養，西安交通大學倫理委員會已批準審核并批準本實驗。按2×107/0.1ml的密度將A549細胞接種于裸鼠后背左側。每兩天用游標卡尺測量腫瘤大小，用公式(長×寬2/2)計算腫瘤體積。當腫瘤體積達到80～100 mm3時，將裸鼠隨機分成兩組：二甲基亞砜(DMSO)與β-欖香烯組。對DMSO組裸鼠的腫瘤注射單純的DMSO，對β-欖香烯組裸鼠的腫瘤注射經過20 μl DMSO稀釋的20 μg或者40 μgβ-欖香烯，每兩天進行一次干預。每天測量一次腫瘤體積，持續20 d。實驗結束后，使用CO2將裸鼠處死，利用RT-PCR試驗進行相關分析。

9統計學方法采用SPSS13.0軟件進行統計分析，資料以均數±標準誤表示。使用Dunnett法檢驗不同組間的統計學差異。P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

1β-欖香烯在A549細胞中上調P53的表達見圖1。經β-欖香烯干預，A549細胞中的P53 mRNA 和蛋白水平的表達均增加(圖1A)。這些結果提示β-欖香烯能夠上調A549細胞中的P53表達。進一步用Western blot法對腫瘤源性的外泌體進行了量化檢測(圖1B)。對培養過A549細胞的培養基進行系列離心后，提取出外泌體，用乙酸雙氧鈾和甲基纖維素的混合物進行背景染色，電鏡下觀察，發現外泌體呈“杯狀”(圖1C)。Western blot顯示經β-欖香烯處理A549細胞后，外泌體的標志物CD63、flotillin-1以及Hsp70表達增加(圖1D)，提示β-欖香烯能夠促進外泌體的分泌，經β-欖香烯處理的A549細胞分泌出的外泌體的形態也并未發生變化。

2β-欖香烯對肺癌細胞的作用依賴于P53表達 見圖2。對A549細胞進行siRNA干預，獲得siP53轉染組。siP53轉染組與對照組相比，P53蛋白表達水平顯著下降(圖2A)。siP53轉染組與對照組相比，細胞增殖增加(圖2B)。Western blot顯示在siP53轉染細胞中，凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bcl-xl表達變化不明顯(圖2C)。Western blot法檢測了外泌體的釋放，顯示在siP53轉染細胞中顯著下降(圖2D)。結果提示β-欖香烯在siP53轉染細胞中不能發揮抗腫瘤作用。

(Dunnett檢驗，與對照組相比*P<0.05)

(Dunnett檢驗，與對照組相比*P<0.05)

3腫瘤源性外泌體對A549細胞增殖的影響見圖3。 使用MTT法檢測外泌體對A549細胞增殖的影響，結果提示A549細胞源性的外泌體能夠顯著抑制A549和H460細胞的生長(圖3A)，H460細胞源性的外泌體同樣能夠顯著抑制A549和H460細胞的生長(圖3B)。

(對照組相比*P<0.05)

4β-欖香烯在體內抑制腫瘤的生長見圖4。使用A549細胞構建BABL/c裸鼠皮下移植瘤模型。腫瘤構建成功后，用20 μg或者40 μg的β-欖香烯注射入腫瘤，每兩天進行一次。觀察β-欖香烯能夠顯著抑制裸鼠體內腫瘤的生長(圖4A)。P53、Hsp70， flotillin和CD36的mRNA表達水平經β-欖香烯干預后顯著上調(圖4B和4C)。結果提示P53信號通路和外泌體均與β-欖香烯的抗腫瘤生長有關。

(對照組相比*P<0.05)

討論

肺癌是是當今最常見的惡性腫瘤，也是引起死亡的主要原因之一。手術、放療以及化療是目前肺癌患者的主要治療方法[6]。盡管目前在一些治療手段上取得了一些進展，但治療效果仍不能夠滿意。近期β-欖香烯已被批準用于肺癌的治療，前期研究也發現β-欖香烯在體內外均具有抗腫瘤作用，然而其具體抗腫瘤機制仍不清楚。

眾所周知，β-欖香烯能夠促進P53表達的上調，而P53的表達上調又與腫瘤抑制相關[7]，本課題前期實驗證實，β-欖香烯的干預能夠顯著降低A549細胞的增殖，同時β-欖香烯能夠顯著下調Bcl-2 和Bcl-xl的表達，但對Bax 和Bak的表達影響較少。已有研究證實，抗腫瘤藥物可以通過P53依賴或者非依賴途徑引起細胞凋亡[8]。然而P53途經在β-欖香烯誘導肺癌細胞凋亡中的作用仍不清楚，為了探索P53在β-欖香烯作用中是否發揮作用，我們用siRNA構造siP53轉染組，進行后續的研究。在siP53轉染組，Bcl-2 和Bcl-xl的表達變化很少，提示β-欖香烯是通過P53依賴途徑誘導A549細胞凋亡。

我們發現β-欖香烯能夠上調腫瘤源性的外泌體的表達。一些研究已經發現腫瘤細胞能夠分泌外泌體樣微泡，其中包含多種蛋白，例如CD63、熱休克蛋白、flotillin-1以及MHCⅠ類分子[9]，而腫瘤源性的外泌體在腫瘤發展過程中又起了重要的作用。目前的研究結果顯示β-欖香烯能夠通過P53依賴途徑上調外泌體的分泌。因此，我們推測β-欖香烯主要通過兩種途徑來調節腫瘤細胞生長。一種是β-欖香烯通過上調P53和下調Bcl-2 和Bcl-xl以激活凋亡相關途徑，另一種是外泌體依賴途徑。為了探索腫瘤源性外泌體的生物學功能，對培養經β-欖香烯干預過的A549細胞的培養基進行一系列離心分離，提取出外泌體，電鏡觀察發現A549細胞源性的外泌體有典型的磷脂雙分子層結構，直徑在30～100 nm。進一步探索A549細胞源性的外泌體是否能夠影響肺癌細胞的增殖，發現A549細胞源性的外泌體可以抑制肺癌細胞的增殖。然而，有些文獻報道BT-474源性的外泌體促進了BT-474的增殖[10]，這些證據提示腫瘤源性的外泌體有抗腫瘤及促進腫瘤的雙重作用，而出現這些有爭議的結果可能是因為外泌體、應答細胞及環境三因素之間復雜的作用關系所致[11]。

本研究中仍存在一些局限性，本研究中，體外研究使用劑量為200 μM的β-欖香烯，體內的研究中則將計量為20 μg的β-欖香烯溶解于20 μl的DMSO中用于研究，而以上β-欖香烯的劑量是否可以直接用于人體仍需進一步探討。

參考文獻

[1]苗久旺，張欽德.姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡的信號途徑研究進展[J].陜西中醫，2014，35(12)：1692-1694.

[2]謝恬，李鋮璐，王淑，等.欖香烯脂質體系列靶向抗癌天然藥物基礎研究進展[J].中國中西醫結合雜志，2014，34(4)：507-512.

[3]高紅軍，秦海峰.欖香烯治療非小細胞肺癌的作用機制研究進展[J].現代醫學生物進展，2010，10(21)：4149-4151.

[4]Tu K，Zheng X，Zhou Z，etal.Recombinant human adenovirus-p53 injection induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines mediated by p53-Fbxw7 pathway， which controls c-Myc and cyclin E[J].PloS one 2013，8(7)：e68574.

[5]Shen C，Buck AK， Liu X，etal.Gene silencing by adenovirus-delivered siRNA[J].FEBS Lett，2003，539(1-3)：111-114.

[6]劉又寧.呼吸內科學高級教程[M].北京：人民軍醫出版社，2012:390-415.

[7]Meek DW.Regulation of the p53 response and its relationship to cancer[J].Biochem J. 2015，469(3)：325-46.

[8]Mak AS.p53 in cell invasion，podosomes， and invadopodia[J].Cell Adh Migr，2014，8(3)：205-214.

[9]Zhang X，Yuan X，Shi H，etal.Exosomes in cancer：small particle，big player[J]. J Hematol Oncol，2015，8：83.

[10]Ciravolo V， Huber V， Ghedini GC，etal. Potential role of HER2-overexpressing exosomes in countering trastuzumab-based therapy[J].J Cell Physiol，227(2)：658-667.

[11]Zhao L， Liu W， Xiao J，etal.The role of exosomes and exosomal shuttle microRNA in tumorigenesis and drug resistance[J]. Cancer Lett，2015，56(2)：339-346.

(收稿：2015-06-08)

【中圖分類號】R734.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.003

*陜西省自然科學基金資助項目(2012JC2-06)

△西安交通大學基礎醫學院腫瘤研究所

▲通訊作者