苯酚硫酸法和高錳酸鉀滴定法測(cè)定香菇多糖含量的比較

雷于國(guó)　王嘉銘　胡國(guó)元　雷遠(yuǎn)征（. 湖北裕國(guó)菇業(yè)股份有限公司，湖北 隨州 44300；. 武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074）

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苯酚硫酸法和高錳酸鉀滴定法測(cè)定香菇多糖含量的比較

雷于國(guó)1王嘉銘2胡國(guó)元2*雷遠(yuǎn)征1
（1. 湖北裕國(guó)菇業(yè)股份有限公司，湖北 隨州 441300；2. 武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074）

摘要為確定一種比較準(zhǔn)確、方便的香菇多糖測(cè)定方法，比較了苯酚硫酸法和高錳酸鉀滴定法測(cè)定香菇多糖含量的差異：兩種方法均穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性較好。但苯酚硫酸法測(cè)定香菇多糖含量高于高錳酸鉀滴定法，苯酚硫酸法不僅靈敏度高，而且回收率也高于高錳酸鉀滴定法；高錳酸鉀滴定法操作也較繁瑣。相對(duì)而言，苯酚硫酸法是測(cè)定香菇多糖較為理想的方法。

關(guān)鍵詞香菇多糖；苯酚硫酸法；高錳酸鉀滴定法；含量測(cè)定

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)香菇多糖的研究比較深入，其測(cè)定的方法主要有比色法、滴定法、高效液相色譜法、薄層層析法等[1]。本試驗(yàn)采用苯酚硫酸法和高錳酸鉀滴定法對(duì)同一批樣品香菇多糖含

量進(jìn)行了比較研究，旨在為以香菇多糖為有效成分的香菇原料和香菇產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

香菇子實(shí)體1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)均由湖北裕國(guó)菇業(yè)股份有限公司提供。

試劑：硫酸、葡萄糖、無(wú)水乙醇、重蒸酚、鹽酸、硫酸鐵銨、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、高錳酸鉀等，均為分析純。

設(shè)備：Genesys 10s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific），AL104電子分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司），KQ2200E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2方法

（1）樣品的制備。取經(jīng)粉碎過(guò)2.00 mm篩的香菇樣品10 g加入200 mL水，沸水浴提取2.5 h，過(guò)濾收集濾液，濾渣加入200 mL水，沸水浴提取2 h，過(guò)濾收集濾液，合并2次濾液，濃縮至30 mL，加入90 mL95%乙醇，靜置后離心，棄去上清液，加入75%乙醇10 mL，離心，棄去上清液，用50 mL水將沉淀洗入燒瓶中，加入25%鹽酸15 mL，沸水浴2.5 h，過(guò)濾到100 mL容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度，備用。

（2）苯酚硫酸法。①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》進(jìn)行[2]。②香菇子實(shí)體多糖含量測(cè)定：3批香菇子實(shí)體干粉分別取10 g按1. 2（1）項(xiàng)下―樣品的制備‖方法制備樣品溶液，分別取1 mL樣品溶液，按中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》中的苯酚硫酸法測(cè)定[2]。③精密度試驗(yàn)：在按1.2（2）中②項(xiàng)方法測(cè)定香菇1號(hào)樣品多糖含量時(shí)，連續(xù)測(cè)定6次考察儀器精密度。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：在按1.2（2）中②項(xiàng)方法測(cè)定香菇1號(hào)樣品多糖含量反應(yīng)結(jié)束后0 min，5 min，10 min，20 min，40 min，60 min，120 min的吸光度[3]。⑤回收率實(shí)驗(yàn)：分別量取3份香菇1號(hào)樣品溶液0.4 mL于試管中，依次添加100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.36 mL，0.30 mL，0.24 mL，并加入水使體積達(dá)到1 mL，空白對(duì)照為水1 mL，測(cè)定多糖含量，計(jì)算回收率[3]。⑥重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：稱取同一批次香菇樣品3份，按照1.2（1）項(xiàng)下―樣品的制備‖方法和1.2（2）中②項(xiàng)下―樣品多糖含量測(cè)定‖方法進(jìn)行操作，考察操作方法的重現(xiàn)性[3]。

（3）高錳酸鉀滴定法。①香菇多糖含量的測(cè)定：3批香菇子實(shí)體干粉分別取10 g按1.2（1）項(xiàng)下―樣品的制備‖方法制備樣品溶液，分別取樣品溶液10 mL加入燒杯中，然后加入25 mL費(fèi)林試劑甲液和乙液，加入40 mL蒸餾水。加熱溶液，使4 min內(nèi)沸騰，然后保持沸騰2 min，趁熱過(guò)濾，用60 ℃100 mL蒸餾水洗滌三角瓶和沉淀，棄去濾液，取50 mL硫酸鐵銨溶液使濾紙上的沉淀溶解，然后用50 mL60 ℃熱水洗滌，取濾液，加入20 mL2 mol/L硫酸，用高錳酸鉀滴定至微紅色并保持30 s不褪色，記錄高錳酸鉀的消耗量，計(jì)算香菇多糖含量[4～6]。②回收率實(shí)驗(yàn)：分別量取3份香菇1號(hào)樣品提取溶液4 mL于燒杯中，加入100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液3.6 mL，3.0 mL，2.4 mL，加水使體積達(dá)到10 mL，按照1.2（3）中①項(xiàng)方法用高錳酸鉀進(jìn)行滴定，計(jì)算香菇多糖含量[1,3]。③重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：稱取同一批次香菇樣品3份，按照1.2（1）項(xiàng)下―樣品的制備‖方法和1.2（3）中①項(xiàng)下―樣品多糖含量測(cè)定‖方法進(jìn)行操作，考察操作方法的重現(xiàn)性[3]。

2　結(jié)果與分析

2.1苯酚硫酸法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及回歸方程的建立。根據(jù)NYT 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》方法，制作的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的線性回歸，獲得吸光度與葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程：Y＝1.0097X－0.0085，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9996，表明方程的擬合度較好。

圖1　苯酚硫酸法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）精密度的測(cè)定結(jié)果。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6），6次測(cè)定吸光度A分別為1.062，1.063，1.060，1.060，1.061，1.062，所測(cè)6次RSD為0.12%。

（3）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸減小，0 min，5 min，10 min，20 min，40 min，60 min，120 min的吸光度A分別為1.061，1.059，1.059，1.058，1.058，1.057，1.053。建議在40 min內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

（4）香菇多糖含量的測(cè)定結(jié)果。香菇1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)中多糖含量3次檢測(cè)均在3.5%以上（表1），符合無(wú)限極（中國(guó)）有限公司的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

表1　苯酚硫酸法測(cè)定香菇多糖含量及重現(xiàn)性的結(jié)果

（5）回收率實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果。通過(guò)加樣回收率的測(cè)定，可以考驗(yàn)試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照，以苯酚硫酸法進(jìn)行香菇多糖的含量分析結(jié)果，加樣平均回收率為101.07%，RSD為0.55（表2），所以本方法的可信度較高。

（6）重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果。為考察上述測(cè)定方法是否可靠，用苯酚硫酸法進(jìn)行香菇多糖的含量分析，結(jié)果如表1所示，3批次樣品的RSD分別為0.20%，0.20%，0.12%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.2高錳酸鉀滴定法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2　苯酚硫酸法和高錳酸鉀滴定法的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：（1）苯酚硫酸法樣品含量為42.36 μg，高錳酸鉀滴定法為14 mg；（2）平均回收率，苯酚硫酸法為101.07%，高錳酸鉀滴定法為93.0%；（3）RSD，苯酚硫酸法為0.55%，高錳酸鉀滴定法為3.2%。

（1）香菇多糖含量的測(cè)定結(jié)果。由表3可知，香菇1號(hào)和香菇2號(hào)3次檢測(cè)中1次符合無(wú)限極（中國(guó)）有限公司的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，香菇3號(hào)3次檢測(cè)中3次均符合無(wú)限極（中國(guó)）有限公司的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

表3　高錳酸鉀滴定法測(cè)定香菇多糖含量及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（2）回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。通過(guò)加樣回收率的計(jì)算，可以考察試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，以高錳酸鉀滴定法進(jìn)行香菇多糖含量的分析結(jié)果，回收率為93%（表2），RSD 為3.2%，可見(jiàn)本方法較為準(zhǔn)確。

（3）重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果。為考察上述測(cè)定方法是否可靠，設(shè)計(jì)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，用高錳酸鉀滴定法進(jìn)行香菇多糖的含量分析，結(jié)果如表3所示，3批次樣品的RSD分別為0.12%，0.15%，0.44%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

3　討　論

苯酚硫酸法的顯色化合物和香菇多糖的溶液均為橙黃色，易導(dǎo)致實(shí)測(cè)值偏高，建議先進(jìn)行脫色處理再測(cè)定；苯酚易氧化，測(cè)定過(guò)程中要注意避光，操作要迅速。高錳酸鉀滴定法所測(cè)結(jié)果偏低，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大，操作較繁瑣。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種方法的重現(xiàn)性均較理想。苯酚硫酸法的靈敏度比高錳酸鉀滴定法高，但特異性不夠強(qiáng)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。而高錳酸鉀滴定法的測(cè)定結(jié)果偏低，且靈敏度不夠高。苯酚硫酸法的回收率高于高錳酸鉀滴定法。

本研究認(rèn)為苯酚硫酸法是測(cè)定香菇多糖較為理想的方法，較適用于基層單位使用，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的結(jié)論一致。

致謝感謝湖北裕國(guó)菇業(yè)股份有限公司的資助和武漢工程大學(xué)的支持！

參考文獻(xiàn)

[1] 于村, 丁鋼, 強(qiáng)俞, 等. 莎香菇多糖測(cè)定的方法學(xué)研究[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2000, 16(3): 245-246.

[2] NT/Y 1676-2008. 食用菌中粗多糖含量的測(cè)定[S]. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn), 2008.

[3] 郭曉蕾, 朱思潮, 翟旭峰, 等. 硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測(cè)定靈芝多糖含量比較[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2010, 28(9): 2000-2002.

[4] GB/T 5009.7-2009. 食品中還原糖的測(cè)定[S]. 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn), 2009.

[5] 香菇多糖含量檢驗(yàn)指引[S]. 無(wú)限極(中國(guó))有限公司中草藥原料香菇驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn), 2015.

[6] GB/T 15672-2009. 食用菌中總糖含量的測(cè)定[S]. 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn), 2009.

云南南華縣多措并舉大力發(fā)展野生食用菌產(chǎn)業(yè)

野生菌產(chǎn)品是云南南華縣產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大特色。近年來(lái)，該縣先后建成野生食用菌交易市場(chǎng)3個(gè)，培育野生食用菌收購(gòu)經(jīng)營(yíng)戶100余個(gè)，成為中國(guó)西南地區(qū)重要野生食用菌交易集散地之一，從2003年起成功舉辦12屆“中國(guó)〃南華野生菌美食文化節(jié)”大力宣傳南華野生食用菌，并于2014年6月起創(chuàng)建中國(guó)〃南華野生菌信息港，吸引國(guó)內(nèi)外客商前來(lái)品嘗生態(tài)美食、投資野生食用菌等產(chǎn)業(yè)，使野生食用菌通過(guò)網(wǎng)絡(luò)走向世界。產(chǎn)品出口日本、韓國(guó)、歐洲等國(guó)家和地區(qū)，2015年，全縣野生食用菌集散交易量6738噸，交易額4.08億元。

為了讓“山貨變商品，商品變精品，精品變高端”，南華縣努力打造野生食用菌品牌。2015年12月31日，“南華松茸”通過(guò)了國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)形式審查。目前，該縣共有野生食用菌商標(biāo)15件，其中彝香、雲(yún)蕈、宏怡3件為云南省著名商標(biāo)。

（摘編自2016.2.22《中國(guó)食用菌商務(wù)網(wǎng)》http://www.vegnet.com.cn/News/1050011.html）

Comparison of the content of lentinan with the phenol sulfuric acid and the potassium permanganate titration method

Lei Yuguo1Wang Jiaming2Hu Guoyuan2*Lei Yuanzheng1

(Hubei Yuguo Gu Ye Co., Ltd., suizhou 441300, China; 2. School of Chemical Engineering & Pharmacy, Wuhan Institute of Technology , Wuhan 430074, China)

AbstractIn order to determine a more accurate and convenient method for the content determination of lentinan, the differences between the phenol sulfuric acid and the potassium permanganate titration method for the determination of content of lentinan were compared. The result showed that the determination value of the phenol sulfuric acid method was higher than the potassium permanganate titration method, and that the phenol sulfuric acid method was not only higher in sensitivity，but also was satisfied of restore rate, and that the operation of the potassium permanganate titration method was complicated. The two methods are stable and feasible, with good reproducibility. The phenol sulfuric acid method was more reliable and accurate by comparison，it can be considered as the optimum assay method for the content determination of lentinan.

Key wordsLentinan; the phenol sulfuric acid method; the potassium permanganate titration method; content determination

*通訊作者：胡國(guó)元（1965—），男，教授，博士，從事食藥用菌發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物研究，E-mail：hgy701@163.com

作者簡(jiǎn)介：雷于國(guó)（1966—），男，高級(jí)經(jīng)濟(jì)師，從事企業(yè)管理

中圖分類號(hào)：S646

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-0934（2016）02-094-04