低氧環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子表達(dá)的影響

周智涓，伍　衛(wèi)，黃穗花，劉　茂，陳　劍

中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院(廣東珠海 519000)

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低氧環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子表達(dá)的影響

周智涓，伍衛(wèi)，黃穗花，劉茂，陳劍

中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院(廣東珠海 519000)

摘要：目的觀察低氧環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)三種交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子內(nèi)皮素-1(ET-1)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)表達(dá)的影響。方法體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs至第三代，應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測BMSCs各代細(xì)胞中ET-1、EPO和G-CSF蛋白表達(dá)水平。BMSCs培養(yǎng)至第三代后，更換無血清無糖培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置入缺氧培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)2 h、6 h、12 h及24 h，分別檢測上述四組細(xì)胞ET-1、EPO、G-CSF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果大鼠BMSCs在常氧狀態(tài)下具有分泌神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子ET-1、EPO、G-CSF的功能。低氧環(huán)境可誘導(dǎo)大鼠BMSCs細(xì)胞ET-1、EPO、G-CSF蛋白表達(dá)水平上調(diào)，ET-1、EPO表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間延長而進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論低氧環(huán)境能顯著上調(diào)大鼠BMSCs交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子的表達(dá)水平，促進(jìn)心肌交感神經(jīng)重構(gòu)，可能與BMSCs移植治療后心律失常副反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；交感神經(jīng)重構(gòu)；促紅細(xì)胞生成素；內(nèi)皮素-1；粒細(xì)胞集落刺激因子

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新、自我維持以及多向分化的潛能，被認(rèn)為是當(dāng)前干細(xì)胞移植研究領(lǐng)域極具前景的種子細(xì)胞之一[1]。BMSCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，自分泌或促進(jìn)心肌細(xì)胞分泌促血管生長的細(xì)胞因子，從而直接和間接誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，挽救缺血心肌[2-3]。

然而，BMSCs移植治療心肌梗死的安全性尚不確切。BMSCs移植治療具有致心律失常的副反應(yīng)，目前觀點(diǎn)認(rèn)為其心律失常的發(fā)生可能與心肌交感神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)密切相關(guān)[4-5]。近年體外研究還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulated factor，G-CSF)具有促進(jìn)心肌梗死區(qū)神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的表達(dá)、提高交感神經(jīng)張力以及營養(yǎng)神經(jīng)的作用，從而促進(jìn)心肌交感神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展[6-8]。那么，BMSCs移植治療的致心律失常作用是否與其分泌上述神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子(ET-1、EPO、G-CSF)有關(guān)，以及低氧誘導(dǎo)環(huán)境下能否上調(diào)BMSCs細(xì)胞上述因子的表達(dá)水平呢？目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察常氧條件下大鼠BMSCs能否分泌神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子ET-1、EPO、G-CSF及其分泌特點(diǎn)；利用低氧誘導(dǎo)模擬心肌梗死缺氧環(huán)境，進(jìn)一步觀察低氧環(huán)境對(duì)大鼠BMSCs交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子表達(dá)的影響，從而為探索BMSCs移植治療致心律失常的原因提高實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量80 g～120 g，3周～4周齡，共6只，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK粵2012-0029)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器胎牛血清(美國Hyclone公司)；DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶兔抗鼠多克隆抗體(Anti-GAPDH antibody，美國Abcam公司)；兔抗鼠內(nèi)皮素-1單克隆抗體(Anti-ET-1 antibody，美國Abcam公司)；重組促紅細(xì)胞生成素多克隆抗體(Anti-EPO antibody，美國CST公司)；兔抗鼠粒細(xì)胞集落刺激因子單克隆抗體(Anti-G-CSF antibody，美國PeproTech 公司)；超凈工作臺(tái)(美國Thermo Forma公司)；缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；超低溫冰箱(美國Thermo公司)等。

1.3BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定取3周～4周齡SD大鼠，無菌條件下分離中雙側(cè)股骨及脛骨，采取全骨髓貼壁分離和消化控制相結(jié)合分離純化BMSCs。顯微鏡下觀察原代(P0)BMSCs生長情況及形態(tài)變化，細(xì)胞增殖至培養(yǎng)皿80%～90%時(shí)，處于對(duì)數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，離心機(jī)離心、重懸，傳代培養(yǎng)。首次傳代為P1，其后依次為P2、P3等，每天觀察細(xì)胞生長情況。采用流式細(xì)胞儀檢測P3期BMSCs細(xì)胞表面抗原CD44H、CD45、CD29、CD11b/c和CD90.1的表達(dá)情況。

1.4實(shí)驗(yàn)分組為分析常氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞分泌神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子ET-1、EPO、G-CSF特點(diǎn)，按照細(xì)胞培養(yǎng)周期將細(xì)胞分為3組：P1期(第一代BMSCs細(xì)胞)、P2期(第二代BMSCs細(xì)胞)、P3期(第三代BMSCs細(xì)胞)。分別檢測三代細(xì)胞ET-1、EPO、G-CSF蛋白表達(dá)水平。為分析低氧環(huán)境對(duì)大鼠BMSCs細(xì)胞分泌神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子的影響，取第三代BMSCs細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。BMSCs培養(yǎng)至第三代(P3期)后，更換無血清無糖培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置入94%N2、5%CO2、1%O2缺氧培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)2 h、6 h、12 h及24 h，分別檢測上述4組細(xì)胞ET-1、EPO、G-CSF蛋白表達(dá)水平。

1.5蛋白印跡每瓶細(xì)胞加入裂解液后，用槍吹打數(shù)下，置于冰上并用水平搖床搖晃使裂解液和細(xì)胞充分接觸。充分裂解后，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。提取總蛋白后，立即測定蛋白濃度。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。按說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及配制BCA工作液。將提取的總蛋白加入5×SDS蛋白緩沖液，100 ℃煮沸5 min，置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩⒌鞍子肂radford法定量后，選擇不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠(G-CSF15%，ET-1 12%，EPO12%)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉后，加入相應(yīng)的一抗，室溫下孵育1 h～2 h或者4 ℃過夜。用TBST每次5 min洗3次后，用相應(yīng)的稀釋好的二抗，室溫下孵育1 h～2 h后，用TBST沖洗3次，每次10 min，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。用Gel-Proanalyzer4.0分析目標(biāo)條帶的光密度值。本實(shí)驗(yàn)采用GAPDH作為內(nèi)參照，比較不同處理后上述蛋白表達(dá)的差異。

2結(jié)果

2.1BMSCs細(xì)胞鑒定顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察可見BMSCs為長梭形或纖維狀細(xì)胞，形態(tài)均一，排列密集，呈放射狀或漩渦狀生長(圖1A)。利用流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果提示細(xì)胞CD29、CD90.1表達(dá)呈陽性，CD34、CD45和CD11b/c呈陰性，符合BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)(圖1B)。

圖1　BMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞儀鑒定

2.2常氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞ET-1、EPO和G-CSF蛋白表達(dá)應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測BMSCs細(xì)胞 P1、P2及P3三個(gè)培養(yǎng)周期中ET-1、EPO和G-CSF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常氧環(huán)境中BMSCs細(xì)胞P1、P2、P3三個(gè)培養(yǎng)周期均可檢測到ET-1、EPO和G-CSF蛋白表達(dá)，提示BMSCs細(xì)胞能夠自分泌上述三種蛋白。P3期BMSCs細(xì)胞ET-1蛋白表達(dá)較P1、P2期顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P2期與P1期BMSCs細(xì)胞比較，ET-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。P2期BMSCs細(xì)胞EPO蛋白表達(dá)水平較P1、P3期增高(P<0.05)，而P3期與P1期BMSCs細(xì)胞比較發(fā)現(xiàn)前者EPO蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。P2和P3期BMSCs細(xì)胞G-CSF蛋白水平較P1期增高(P<0.05)，而P2和P3 期之間G-CSF蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖4。

注：與BMSCs P1、P2期比較，* P<0.05。

圖2常氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞ET-1蛋白表達(dá)

注：與BMSCs P1期比較，*P<0.05。

注：與BMSCs P1期比較，*P<0.05。

2.3低氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞ET-1蛋白表達(dá)低氧誘導(dǎo)環(huán)境下BMSCs細(xì)胞ET-1蛋白表達(dá)量較常氧對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，且隨缺氧時(shí)間延長而逐漸增高，在缺氧24 h達(dá)到高峰(P<0.05)，提示低氧環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞ET-1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。詳見圖5。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4低氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞EPO蛋白表達(dá)低氧誘導(dǎo)環(huán)境下BMSCs細(xì)胞EPO蛋白分泌量較常氧對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，并隨缺氧時(shí)間延長而進(jìn)行性升高，在缺氧24 h達(dá)到高峰(P<0.05)，提示低氧環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞EPO蛋白表達(dá)水平上調(diào)。詳見圖6。

注：與對(duì)照組比較，* P<0.05。

圖6低氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞EPO蛋白表達(dá)

2.5低氧環(huán)境BMSCs細(xì)胞G-CSF蛋白表達(dá)低氧誘導(dǎo)環(huán)境下BMSCs細(xì)胞G-CSF蛋白分泌量較常氧對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，但G-CSF蛋白表達(dá)量未隨缺氧時(shí)間延長而進(jìn)一步增加。詳見圖7。

注：與對(duì)照組比較，* P<0.05。

3討論

干細(xì)胞是一類具有自我更新、自我維持和多向分化潛能的細(xì)胞，能表達(dá)、合成或分泌生長因子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)肽及氣體信號(hào)分子等多種生物活性因子。而這些生物活性因子又具有調(diào)節(jié)組織細(xì)胞代謝、分化、增殖、遷移、凋亡等功能[9]。植入干細(xì)胞的分泌功能不僅直接影響植入干細(xì)胞自身的存活和分化，而且是干細(xì)胞移植發(fā)揮其他生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制[10]。本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs發(fā)現(xiàn)，常氧條件下大鼠BMSCs具有分泌神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子ET-1、EPO、G-CSF的作用，低氧環(huán)境能夠顯著增加上述因子的表達(dá)水平，加劇心肌交感神經(jīng)重構(gòu)，從而促使BMSCs移植治療后心律失常的發(fā)生。

ET-1是目前所知最強(qiáng)大的血管收縮因子，最早從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中分離發(fā)現(xiàn)。ET-1主要來源于內(nèi)皮細(xì)胞，可通過旁分泌的形式激活內(nèi)皮素受體并參與心血管系統(tǒng)多種生理病理過程[11]。研究發(fā)現(xiàn)，ET-1與ET-1受體結(jié)合后，可激活P38MAPK、ERK等信號(hào)通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)與分泌NGF，從而促進(jìn)交感神經(jīng)重構(gòu)[12]。在干細(xì)胞相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪源性MSCs可表達(dá)ET-1，但骨髓源性MSCs是否同樣表達(dá)ET-1，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察到BMSCs在P1、P2、P3三代細(xì)胞均可表達(dá)ET-1，且在純化的P3中，ET-1表達(dá)量最高。通過體外單一細(xì)胞培養(yǎng)，排除了造血干細(xì)胞、造血細(xì)胞如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等干擾后，本研究首次發(fā)現(xiàn)骨髓來源的干細(xì)胞BMSCs同樣具有分泌ET-1的作用。本研究還觀察低氧處理對(duì)BMSCs細(xì)胞 24 h內(nèi)ET-1表達(dá)量的影響。首次發(fā)現(xiàn)低氧可增強(qiáng)BMSCsET-1的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在一定缺氧時(shí)程內(nèi)，ET-1表達(dá)量隨缺氧時(shí)程延長而增高，繼續(xù)延長缺氧時(shí)間，ET-1表達(dá)量逐漸回降。這一結(jié)果提示低氧可調(diào)節(jié)BMSCs自分泌功能并可能在缺氧早期即發(fā)揮這一作用，提示這種機(jī)制可能與BMSCs移植治療的致心律失常副反應(yīng)相關(guān)。

另外，BMSCs由中胚層分化而成，可分泌多種支持造血因子，為BMSCs的存活提供營養(yǎng)支持及支架作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可分泌和表達(dá)EPO和G-CSF[13-15]。EPO作為強(qiáng)大的神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進(jìn)軸突再生的作用，還可促進(jìn)腦和脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌NGF，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。G-CSF是一種促進(jìn)粒細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，前期研究證實(shí)G-CSF可通過與粒細(xì)胞集落刺激因子受體結(jié)合，促進(jìn)干細(xì)胞遷移及定位[14，17]。Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)G-CSF可促進(jìn)心肌梗死后大鼠梗死區(qū)域NGF表達(dá)及交感神經(jīng)重分布。而Kuhlmann和Baldo等學(xué)者則持相反觀點(diǎn)，認(rèn)為G-CSF或可通過增加Connexin43表達(dá)而減少心肌梗死室性心律失常的發(fā)生[1，14]。在本研究中，通過蛋白印跡法檢測未分化的BMSCs細(xì)胞EPO和G-CSF蛋白表達(dá)水平，也發(fā)現(xiàn)BMSCs可分泌上述細(xì)胞因子，且晚期成熟的BMSCs中更為明顯，與國內(nèi)外研究結(jié)論一致[15，18]。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)EPO和G-CSF蛋白表達(dá)增加，前者隨缺氧時(shí)間增加而增加，后者則不隨缺氧作用時(shí)間變化而進(jìn)一步變化。該現(xiàn)象說明缺氧可影響B(tài)MSCs細(xì)胞EPO表達(dá)，或可通過持續(xù)分泌EPO而促進(jìn)NGF表達(dá)，促進(jìn)交感神經(jīng)重構(gòu)，從而誘發(fā)室性心律失常。另外，缺氧也可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞G-CSF蛋白表達(dá)，但是否能夠通過G-CSF表達(dá)水平變化這一途徑而影響心肌交感神經(jīng)重構(gòu)尚有待后續(xù)研究探索。

低氧環(huán)境可能通過以下途徑影響B(tài)MSCs細(xì)胞交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子的表達(dá)：低氧可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制P53信號(hào)表達(dá)，抑制白介素1β轉(zhuǎn)化酶生成，減少氧化應(yīng)激損傷和氧自由基生成，穩(wěn)定線粒體電位，從而保持移植入宿主的干細(xì)胞存活率[19]；低氧可增強(qiáng)了干細(xì)胞的分化能力[20]；低氧還可調(diào)節(jié)干細(xì)胞某些基因和受體表達(dá)并影響多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，如ERK1/2、P38 MAPK、JNK通路等，參與其下游多種功能的調(diào)節(jié)，促進(jìn)多種生物活性因子的合成與分泌[19，21]。

本研究具有一些不足之處。首先，本研究僅為初期體外實(shí)驗(yàn)，暫未進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)或人體研究。其次，既往研究提示外源性ET-1可誘導(dǎo)BMSCs分化成心肌樣細(xì)胞，本研究采用第1代～第3代BMSCs細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期BMSCs可表達(dá)ET-1，而BMSCs自分泌的ET-1又能否促進(jìn)其自身分化并影響其他細(xì)胞因子的分泌，本研究未進(jìn)一步探討。再次，本研究僅報(bào)告了上述三種細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平，關(guān)注的細(xì)胞因子種類有限，且未報(bào)告低氧對(duì)BMSCs轉(zhuǎn)錄水平的影響；本研究未能縱向探討B(tài)MSCs細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子后如何通過旁分泌影響周圍心肌細(xì)胞NGF表達(dá)，如何進(jìn)一步誘導(dǎo)心律失常發(fā)生。為此，本課題組正在進(jìn)行后續(xù)研究。最后，本研究未進(jìn)一步觀察不同氧濃度下BMSCs分泌各細(xì)胞因子水平是否存在差異，且觀察時(shí)間僅限于24 h內(nèi)，未能橫向多層次比較，有待更多同行的進(jìn)一步合作與研究。

綜上所述，大鼠BMSCs細(xì)胞具有分泌神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)因子ET-1、EPO、G-CSF的功能，低氧環(huán)境能顯著上調(diào)其上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平，促進(jìn)心肌交感神經(jīng)重構(gòu)，可能與BMSCs移植治療后心律失常副反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-10-21)

中圖分類號(hào)：R329

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．013

文章編號(hào)：1672-1349(2016)06-0599-05

通訊作者：伍衛(wèi)，E-mail：wuwei9@mail.sysu.edu.cn

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.B2013155)