Box-BehnKen響應面法優化紫穗槐根中總異黃酮提取工藝

2016-06-01 08:32:46趙昱瑋南敏倫司學玲赫玉芳

中成藥 2016年5期

趙昱瑋，南敏倫，于　淼，司學玲，呂　娜，赫玉芳*

（1.吉林省中醫藥科學院，吉林長春130012；2.長春三德天晟科技有限公司，吉林長春130012；3.修正藥業長春高新制藥有限公司，吉林長春130012；4.吉林農業大學，吉林長春130118）

趙昱瑋1，南敏倫1，于淼2，司學玲3，呂娜4，赫玉芳1*

摘要：目的優化紫穗槐根中總異黃酮的提取工藝。方法以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷為指標，采用紫外分光光度法測定總異黃酮含有量。在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法研究乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取次數對紫穗槐總異黃酮提取率的影響。結果最優提取工藝為乙醇體積分數70％，料液比1∶13，提取時間3 h，提取次數3次。在此條件下，紫穗槐根總異黃酮的提取率為5.59％。結論該工藝簡便可靠，提取率高，可為紫穗槐根中總異黃酮的開發利用奠定基礎。

關鍵詞：紫穗槐；根；總異黃酮；提取工藝；Box-Behnken響應面法

紫穗槐AmorPha fruticosa L.為豆科紫穗槐屬多年生落葉灌木，別名棉槐、椒條、棉條、穗花槐［1］，在我國東北、華北、西北地區及山東、安徽、江蘇、河南、湖北、廣西、四川等地均有栽培，其花清熱、涼血、止血［2］；葉微苦、涼，具有祛濕消腫功效，主治癰腫、濕疹、燒燙傷［3］。紫穗槐根系發達，可耐瘠、耐水濕，又有固氮、防風固沙等作用［1］，其化學成分以黃酮為主，此外還含二苯乙烯苷、甘油酯、揮發油及多糖等［4-5］，在抗腫瘤、抗病毒、保肝、殺蟲等方面顯示出潛在的藥用價值［6-7］。該資源比較豐富，但尚無其總異黃酮提取工藝的報道。

本實驗在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取次數為自變量，總異黃酮提取率為因變量，利用Box-Behnken響應面法優化提取工藝，以期為紫穗槐根中總異黃酮的提取與開發提供實驗依據。

1 儀器與試藥

UV-759S型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；BS2010S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE52-98型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；ZK-82A型電熱真空干燥箱（上海市實驗儀器總廠）。

毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（自制，含有量> 98％）。甲醇、無水乙醇、95％乙醇均為分析純（北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水。

紫穗槐根采自長春凈月開發區，經吉林省中醫藥科學院趙全成研究員鑒定為豆科植物紫穗槐AmorPha fruticosa L.的根。

2 方法與結果

2.1 總異黃酮的測定［8-9］

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 檢測波長的選擇吸取毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在200～400 nm波長范圍內掃描，發現在260 nm處有最大吸收峰，故選擇其作為檢測波長。

2.1.3 標準曲線的繪制精密量取對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，于260 nm波長處測定吸光度，空白溶液作為對照。以各對照品的質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A），得到線性回歸方程為A=0.052 68 X +0.081 43，r=0.999 4，表明毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在5～25 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 含有量的測定方法取供試品溶液適量，于260 nm波長處測定吸光度，標準曲線法計算紫穗槐根提取液中總異黃酮的含有量，計算公式如下。

注：X為總異黃酮提取率（％），c為總異黃酮質量濃度（μg/mL），m為取樣量（g）

2.1.5 供試品溶液的制備將紫穗槐根藥材粉碎，過40目篩，精密稱取適量，乙醇回流提取，放冷，濾過，定容于250 mL量瓶中，再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

鄉鎮電視臺取材范圍狹窄。在取材不足的情況下，電視臺主要把新聞焦點聚焦在時政方面，其中又以縣級領導干部和正常政務活動的鏡頭為主；而對于那些能夠反映基層群眾日常生活、思想風貌、生存環境和社會心聲的民生類新聞的比重較少。新聞報道內容單一，總體價值不高，這些與百姓利益沒有直接性關系的會議新聞觀眾不感興趣，影響了收視率。

2.1.6 精密度試驗取同一供試品溶液適量，平行測定6次，測得RSD為1.8％，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗取同一供試品溶液適量，制備6份樣品進行測定，測得RSD為1.5％，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩定性試驗取同一供試品溶液適量，在0、1、2、4、6、8、10 h進行測定，測得RSD為1.4％，表明溶液在10 h內穩定。

2.1.9 加樣回收率試驗精密吸取含有量已知的供試品溶液6份，分別加入對照品溶液，按“2.1.4”項下方法進行測定，測得平均回收率為99.8％，RSD為1.9％，表明該方法回收率良好。

2.2 提取條件的確定

2.2.1 乙醇體積分數精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在料液比1∶12，回流提取2次，每次1 h，50％、60％、70％、80％、90％乙醇條件下提取，放冷，濾過，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項下方法在260 nm波長處測定吸光度，測得總異黃酮提取率分別為4.27％、5.12％、5.46％、5.48％、5.33％，故選擇70％乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 料液比精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在70％乙醇，回流提取2次，每次1 h，料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16條件下提取，放冷，濾過，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項下方法在260 nm波長處測定吸光度，測得總異黃酮提取率分別為4.38％、5.02％、5.56％、5.49％、5.50％，故選擇料液比為1∶12。

2.2.3 提取時間精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在70％乙醇，料液比1∶12，回流提取2次，提取0.5、1、2、3、4 h條件下提取，放冷，濾過，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項下方法在260 nm波長處測定吸光度，測得總異黃酮提取率分別為4.21％、4.85％、5.51％、5.55％、5.53％，故選擇提取時間為2 h。

2.2.4 提取次數精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共4份，在70％乙醇，料液比1∶12、提取2 h，提取1、2、3、4次條件下提取，放冷，濾過，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項下方法在260 nm波長處測定吸光度，測得總異黃酮提取率分別為4.82％、5.48％、5.52％、5.61％，故選擇提取次數為2次。

2.3 響應面法優選最佳提取條件結合單因素試驗結果，采用Box-Behnken響應面法進行試驗設計，以紫穗槐根總異黃酮提取率為響應值（X），選擇乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數（D）這4個因素，設計4因素3水平，并采用Design-Expert8.0.6軟件進行設計與分析［10-11］。因素水平見表1。結果見表2。

表1　因素水平

表2　響應面試驗結果

然后，利用Design-Expert8.0.6軟件進行分析，得到回歸方程X=5.43 +0.19A+0.10B+0.18C+0.23D-0.027AB-0.045AC -0.11AD -0.012BC -0.092BD + 0.15CD-0.21A2-0.10B2-0.15C2-0.26D2。方差分析見表3。

由表3可知，一次項中，乙醇體積分數、提取時間、提取次數對總異黃酮提取率的影響最大，p均<0.000 1；二次項中，提取次數影響最顯著，乙醇體積分數、提取時間次之，p均<0.01。另外，模型的失擬項不顯著（p = 0.001 8），而模型顯著（p<0.000 1），表明方法可靠；信噪比值為13.779，大于4，表明該模型能如實反映試驗結果；相關系數r=0.928 0，表明回歸方程的擬合程度良好；RSD低于10％（2.26％），表明試驗穩定性良好。

表3　方差分析

綜上所述，紫穗槐根總異黃酮的最優提取工藝條件為乙醇體積分數71.96％，料液比1∶12.27，提取時間2.90 h，提取次數2.62次，理論提取率值5.61％。

2.4 驗證試驗考慮到實際可操作性，對上述條件進行了修正，最終確定最優工藝為乙醇體積分數70％，料液比1∶13，提取時間3 h，提取次數3次。然后，以其進行驗證試驗，測得紫穗槐根總異黃酮的平均提取率為5.59％，平均含有量為20.3％，與理論值（5.61％）相近，表明該工藝參數準確可靠。

3 討論

Box-Behnken響應面法可得到最優的考察因素和響應值，避免傳統數理統計存在的問題，最終精確找到最佳點，并可靈敏地考察各因素間的交互作用［12］，彌補正交設計的缺限，具有試驗次數少、周期短、回歸方程精度高、結果直觀等優點［13-14］。

本實驗提取紫穗槐根總異黃酮后，先采用單因素試驗考察了乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取次數對其提取率的影響，然后進行Box-Behnken試驗設計，最后以Design-Expert8.0.6軟件進行數據回歸和方差分析，測得回歸方程的相關系數為0.928 0，表明方程擬合良好。根據響應曲面及等高線圖，得到了各因素間的相互作用，可知其影響大小依次為提取次數>乙醇體積分數>提取時間>料液比。

驗證試驗表明，該方法真實可信，誤差小。最終，確定最優工藝為乙醇體積分數70％，料液比1∶13，提取時間3 h，提取次數3次，在此條件下紫穗槐根總異黃酮提取率為5.59％，總異黃酮平均含有量為20.3％，高于單因素試驗結果，可為紫穗槐根中總異黃酮的開發利用奠定基礎。

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*通信作者：赫玉芳（1973—），女，博士，副研究員，從事植物化學研究與新藥開發，Tel：（0431）86058683，E-mail：hyf_ 1992@ 163.com

作者簡介：趙昱瑋（1983—），男，碩士，從事植物化學研究與新藥開發。Tel：（0431）86058683，E-mail：yuwei5208@163.com

基金項目：吉林省中醫藥科技項目（2014 -Q40）