窄葉鮮卑花葉超聲提取工藝的優(yōu)化

衛(wèi)陽飛， 宋　海， 張宏曦， 楊永建， 李建銀， 岳國仁 *

（1.河西學(xué)院，甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖734000；2.甘肅省張掖市甘州區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅張掖734000；3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000）

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窄葉鮮卑花葉超聲提取工藝的優(yōu)化

衛(wèi)陽飛1， 宋海1， 張宏曦2， 楊永建3， 李建銀3， 岳國仁1 *

（1.河西學(xué)院，甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖734000；2.甘肅省張掖市甘州區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅張掖734000；3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000）

摘要：目的 優(yōu)化窄葉鮮卑花葉的超聲提取工藝。方法 以齊墩果酸和熊果酸的總評值為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 最優(yōu)提取工藝為浸泡時(shí)間2.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)72.7％，液料比32∶1，提取溫度53℃，提取時(shí)間1.633 h（約98 min），齊墩果酸平均提取率為14.03 mg/g，熊果酸為0.984 5 mg/g。結(jié)論 該工藝穩(wěn)定合理，對窄葉鮮卑花的開發(fā)利用具有一定實(shí)踐意義。

關(guān)鍵詞：窄葉鮮卑花；葉；超聲提取；齊墩果酸；熊果酸；響應(yīng)面分析法

窄葉鮮卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand.-Mazz為薔薇科鮮卑花屬植物，主要分布于西藏、青海、甘肅、四川等地，生長在海拔2 400～3 500 m的高山、溪邊、灌木叢中或林緣［1-2］，藏族民間常用其葉作茶飲，用于治療食后腹脹等原因引起的消化不良癥狀，命名為“柳茶”。近年來藥理研究表明，窄葉鮮卑花葉具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［3］、保護(hù)肝損傷［4］、抗氧化促進(jìn)免疫功能［5］、抑制K562和S180腫瘤細(xì)胞生長［6-7］等作用。

窄葉鮮卑花葉中含有豐富的齊墩果酸和熊果酸等三萜類成分，是其最主要的一類活性物質(zhì)［8-11］。在齊墩果酸和熊果酸的提取中，超聲提取與浸提、回流提取等傳統(tǒng)方法比較，具有明顯優(yōu)勢［12-13］。目前，窄葉鮮卑花葉主要以齊墩果酸和熊果酸為指標(biāo)成分來進(jìn)行提取工藝研究，只有閆志慧等［14］對熊果酸采用薄層色譜檢測，并進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)以窄葉鮮卑花葉為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總評OD值［15］為綜合評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，對窄葉鮮卑花葉中齊墩果酸和熊果酸的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為該植物的綜合開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括四元泵、二極管陣列檢測器、智能化柱溫箱、OpenLAB工作站（美國安捷倫公司）；KQ250B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW120D電子分析天平（日本島津公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6020真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 材料 窄葉鮮卑花葉采自甘肅省定西市漳縣遮陽山，經(jīng)蘭州大學(xué)楊永建教授鑒定為薔薇科鮮卑花屬植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand.-Mazz的葉。熊果酸（批號110753-200413）、齊墩果酸（批號100080-200207）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝流程 窄葉鮮卑花葉低溫干燥后粉碎，過60目篩，乙醇浸泡，超聲提取，抽濾，即得。

2.2 HPLC色譜條件 Phenomenex-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸水溶液（88∶12）；體積流量為0.8 mL/min；柱溫30℃；檢測波長210 nm。

2.3 混合對照品溶液的制備與線性關(guān)系考察 精密稱取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，甲醇定容至25 mL量瓶中，制成含0.638 mg/g齊墩果酸、3.85 mg/g熊果酸的混合對照品溶液，精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，得到系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取10 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得到齊墩果酸的回歸方程為Y=5 089X+14.80，在0.063 8～6.38 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7），而熊果酸為Y= 415.5X-1.576，在0.385～38.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9）。色譜圖見圖1。

1.齊墩果酸 2.熊果酸圖1　HPLC色譜圖

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 提取溶劑對提取率的影響 選擇不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇及乙醇（均為100％、90％、80％、70％、60％）作為提取溶劑，將粉碎后的窄葉鮮卑花葉用提取試劑浸泡2.0 h后，超聲（250 W）處理1.5 h，溫度50℃，液料比40∶1，每種溶劑平行3次，取平均值，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著甲醇和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，齊墩果酸和熊果酸的提取率都是先增加后減少，而且80％乙醇時(shí)兩者的提取率均最高，而且乙醇價(jià)格相對便宜，故選擇70％、80％、90％乙醇繼續(xù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖2　提取溶劑對提取率的影響

2.4.2 液料比對提取率的影響 選擇80％乙醇作為提取溶劑，超聲（250 W）1.5 h，溫度50℃，考察液料比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1時(shí)對提取率的影響，每個(gè)液料比平行3次，取平均值，結(jié)果見圖3。由圖可知，當(dāng)液料比為40∶1時(shí)，齊墩果酸和熊果酸的提取率均最高，但其進(jìn)一步增加后，反而均有所下降，可能是與液料比增加時(shí)提取過程的損失也相應(yīng)加大有關(guān)。

圖3　液料比對提取率的影響

2.4.3 提取溫度對提取率的影響 選擇80％乙醇作為提取溶劑，液料比40∶1，提取時(shí)間1.5 h，考察提取溫度為20、30、40、50、60℃對提取率的影響，每個(gè)溫度平行3次，取平均值，結(jié)果見圖4。由圖可知，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，齊墩果酸和熊果酸的提取率均最高，但其進(jìn)一步升高后，反而均有所下降，可能是由于高溫條件下相關(guān)成分發(fā)生了變化。

圖4　提取溫度對提取率的影響

2.4.4 提取時(shí)間對提取率的影響 選擇80％乙醇作為提取溶劑，液料比40∶1，提取溶劑50℃，考察提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0 h時(shí)對提取率的影響，每個(gè)提取時(shí)間平行3次實(shí)驗(yàn)，取平均值，結(jié)果見圖5。由圖可知，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，齊墩果酸和熊果酸的提取率均最高。

圖5　提取時(shí)間對提取率的影響

2.4.5 浸泡時(shí)間對提取率的影響 選擇80％乙醇作為提取溶劑，液料比40∶1，提取溫度50℃，提取時(shí)間1.5 h，考察浸泡時(shí)間0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h時(shí)對提取率的影響，每個(gè)浸泡時(shí)間平行3次，取平均值，結(jié)果見圖6。由圖可知，當(dāng)浸泡時(shí)間為2.0 h和3.0 h時(shí)，齊墩果酸和熊果酸的提取率均最高，從節(jié)約時(shí)間角度考慮，最終選擇2.0 h作為最佳浸泡時(shí)間。

圖6　浸泡時(shí)間對提取率的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)與結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)因素，以總評OD值為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素水平見表1。

表1　因素水平

總評OD值［15］的計(jì)算方法為將各指標(biāo)首先均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的“歸一值”，對取值越大越好的指標(biāo)，采用計(jì)算公式di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）。再將各指標(biāo)“歸一值”求算幾何平均數(shù)，得總評歸一值，計(jì)算公式為OD= （d1d2…dk）1/k（k為指標(biāo)個(gè)數(shù)）。

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交表，試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2　試驗(yàn)方案與結(jié)果

采用Design Expert 8.05軟件，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為響應(yīng)變量，以總評OD值（Y）為考察指標(biāo)，對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到二次回歸方程為Y=-12.9 +0.184A+0.057B+ 0.171C+2.13D+6.12×10-4AB+7.20×10-4AC+2.70× 10-3AD-4.50×10-4BC+8.51×10-3BD+6.37×10-3CD-1.70×10-3A2-1.42×10-3B2-2.08C2-0.894D2。

方差分析見表3，可知該模型極顯著（p<0.000 1），表明不同因素間差異非常明顯；失擬項(xiàng)不顯著（p> 0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.975 5，校正決定系數(shù)Radj2= 0.951 1，表明該模型擬合程度良好，誤差小，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)預(yù)測。各因素的影響程度依次為A>B>D>C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間>提取溫度，其中A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對OD值影響非常顯著，AC較顯著，其他不顯著。

表3　方差分析

根據(jù)回歸方程，繪制響應(yīng)面分析圖，見圖7，得到最佳工藝條件為浸泡時(shí)間2.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)72.66％，液料比32.35∶1，提取溫度52.84℃，提取時(shí)間1.64 h。考慮實(shí)際操作，將最佳工藝修正為浸泡時(shí)間2.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)72.7％，液料比32∶1，提取溫度53℃，提取時(shí)間1.633 h（98 min）。在此條件下，預(yù)測總評OD值為0.998 1。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證上述最佳條件的可靠性，進(jìn)行了3組平行實(shí)驗(yàn)，測得齊墩果酸和熊果酸的平均提取率分別為14.03 mg/g和0.984 5 mg/g，平均OD值為0.964 8，與預(yù)測值（0.998 1）接近，表明該工藝條件穩(wěn)定可靠。

圖7　響應(yīng)面交互作用圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素試驗(yàn)來確定主要因素及水平，在此基礎(chǔ)上，再采用響應(yīng)面法對窄葉鮮卑花葉中齊墩果酸和熊果酸的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)72.7％，液料比32∶1，提取溫度53℃，提取時(shí)間1.633 h（98 min），彌補(bǔ)了以往正交試驗(yàn)無法得到最佳組合因素的不足。然后，通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各因素的影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間>提取溫度。綜上所述，該提取工藝簡單可靠，目標(biāo)成分損失小，可為窄葉鮮卑花葉的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

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*通信作者：岳國仁（1966—），男，博士，教授，從事有機(jī)化合物的應(yīng)用與合成研究。E-mail：xinziwuzhijin@163.com

作者簡介：衛(wèi)陽飛（1987—），女，碩士，助教，從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。Tel：18093612285，E-mail：wyfhxxy@163.com

基金項(xiàng)目：河西學(xué)院青年教師科研基金項(xiàng)目（QN2014-15）

收稿日期：2015-08-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.045

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1167-05