藏藥刀豆總黃酮超聲提取的優化及其抗氧化活性

孔子銘， 謝建鋒， 李穎晨， 王　穎， 韓泳平

（西南民族大學少數民族藥物研究所，四川成都610041）

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藏藥刀豆總黃酮超聲提取的優化及其抗氧化活性

孔子銘， 謝建鋒， 李穎晨， 王穎， 韓泳平*

（西南民族大學少數民族藥物研究所，四川成都610041）

摘要：目的 優化超聲提取藏藥刀豆總黃酮的工藝條件，并考察其抗氧化活性。方法 采用單因素法和響應面設計法，優化超聲提取藏藥刀豆總黃酮的工藝條件，并測試提取物清除氧自由基和羥自由基的能力。結果 最優提取條件為乙醇體積分數50.88％，料液比1∶20.71，溫度72.32℃，該條件下總黃酮得率為0.675％。而且，提取物具有清除超氧自由基和羥自由基的能力，并與總黃酮含有量呈正相關性。結論 該方法可用于藏藥刀豆中總黃酮的提取，而且提取物具有較強的抗氧化活性。

關鍵詞：藏藥刀豆；總黃酮；超聲提??；單因素；響應面設計；抗氧化活性

藏藥刀豆又名洋刀豆、直生刀豆，是藏藥中常用的一種藥材，為豆科植物刀豆Canavalia gladiata（Jacq.）DC.的種子，原產西印度、中美洲和加勒比海地區，我國主要分布于長江流域及其以南各省區，以華中、華南為多［1］，植株為莖矮生或半蔓生，莢果較蔓性刀豆小，種子白色，腎形。其味甘，性溫，歸胃、腎經，功效降氣止呃，溫腎助陽，可用于治療虛寒之呃逆、嘔吐，腎虛腰痛。《本草綱目》記載，刀豆能“溫中下氣，利腸胃，止呃逆，益腎補元”［2］，而藏藥刀豆為衛生部公布的第一批“藥食兼用食品”，具有良好的保健治療作用［3］?，F代藥理研究表明，藏藥刀豆中的主要藥用成分為刀豆球蛋白、脲酶以及黃酮類成分等，目前對其在食品和保健品中的應用大多集中于營養價值較高的蛋白質類成分［4］，以及具有一定抗腫瘤作用的L-刀豆氨酸［5］，但尚無黃酮類成分的報道。由于超聲提取法具有提取效率高、適應性廣、提取藥液雜質少等優點，因此在植物有效成分的提取方面已獲得較為廣泛的應用［6-7］。本實驗采用響應面設計法確定超聲提取刀豆總黃酮優化條件，同時還對其體外抗氧化活性進行了初步考察，可有益于該生物資源的合理利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材和對照品 藏藥刀豆（成都市荷花池藥材市場）。柚皮素對照品（含有量98％，四川成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-11041107）；抗壞血酸對照品（天津瑞金特化學品有限公司）。

1.1.2 試劑 石油醚（60～90℃，天津市富宇精細化工有限公司）；無水乙醇（成都海興化工試劑廠）；濃鹽酸（成都市中科試劑廠）；鄰苯三酚（天津市光復精細化工研究所）；鄰二氮菲（成都化學試劑廠）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵（天津市瑞金特化學品有限公司）；雙氧水（30％）、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷（天津博迪化工股份有限公司）；三氯乙酸、四氫硼鈉（成都市科龍化工試劑廠）；鐵氰化鉀（成都市聯合化工試劑研究所）；三氯化鐵（上海山浦化工有限公司）。所有試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 UnicamUV500紫外可見分光光度計（美國Themo Nicolet公司）；AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；800離心機（江蘇省金壇市正基儀器有限公司）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（金壇市榮華儀器制造有限公司）；KQ52001超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 黃酮類型的鑒別 藏藥刀豆經打粉、干燥后，從中取適量按一定料液比加入溶劑，提取后趁熱過濾，合并濾液，微孔濾膜過濾，濃縮定容至50 mL。在試管中取醇提液適量，加入四氫硼鈉，滴入1％鹽酸溶液后呈紫紅色，說明為二氫黃酮類成分，然后進行紫外全掃描，得到其吸收圖譜。另取柚皮素對照品適量，50％乙醇溶解，進行紫外全掃描，得到其吸收圖譜。

1.2.2 標準曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的柚皮素對照品20 mg，50％乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，搖勻。再分別吸取標準液1、2、4、6、8 mL，置于50 mL量瓶中，加50％乙醇至刻度，搖勻，在290 nm處測定吸光度。以柚皮素質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

1.2.3 單因素試驗 取干燥后的藏藥刀豆粉末1 g，按一定料液比加入溶劑，在設定條件下（提取次數、溫度、乙醇體積分數、料液比）進行超聲回流提取。然后，趁熱過濾，石油醚萃取后取下層液，微孔濾膜過濾，定容至50 mL，按“1.2.2”項下方法測定其含有量。

1.2.4 響應面法優化提取條件 在單因素試驗結果的基礎上，選擇乙醇體積分數、料液比、提取溫度這3個最顯著的影響因素作為研究對象，以黃酮得率為響應值，利用Design Expert7.0軟件設計Box-Behnken試驗。以A（乙醇體積分數）、B（料液比）、C（提取溫度）為自變量，以黃酮提取率（Y）為響應值進行分析，每組平行3次，取平均值，得出最優方案。

1.2.5 抗氧化實驗供試液的配制 取藏藥刀豆適量，置于60℃烘箱中干燥，粉碎，過5號篩。稱取5 g，置于100 mL圓底燒瓶中，每次加入60 mL石油醚，65℃下回流脫脂1 h，共兩次，揮干溶劑，藥渣置于150 mL圓底燒瓶中，在51％乙醇、液料比1∶21，72℃條件下超聲回流30 min，抽濾提取液，離心（3 000 r/min）10 min，除去沉淀，澄清液揮干溶劑，得到浸膏，收率為19.32％，冷藏（3～5℃）備用。然后，提取物浸膏用51％乙醇溶解定容于100 mL量瓶中，再分別量取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL，定容于25 mL量瓶中，制成樣品液，冷藏（3～5℃）備用。其質量濃度（相當于原藥材量）分別為10、 20、30、40、50 mg/mL，則總黃酮質量濃度分別為67.1、134.2、201.3、268.4、335.4 μg/mL。

1.2.6 維生素C對照品的配制 稱取維生素C標準品0.671 g，51％乙醇溶解定容于100 mL量瓶中，分別量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，定容于100 mL量瓶中，即得質量濃度分別為67.1、134.2、201.3、268.4、335.4 μg/mL的維生素C對照品。

1.2.7 刀豆總黃酮對超氧陰離子自由基的清除實驗 往試管中加入4.5 mL 50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（pH=8.4）緩沖溶液，25℃水浴中預熱20 min，加入1.0 mL樣品液混勻后，立即加入0.4 mL在25℃下預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚（用新沸水配制的10 mmol/LHCl配制），25℃下反應20 min，加入0.5 mL 1 mol/L HCl終止反應，303 nm下測定吸光度A樣，重復3次，取平均值。自氧化管用1.0 mL 51％乙醇代替樣品，樣品比管用0.3 mL 10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚，空白管用1.0 mL 51％乙醇液代替樣品，再用0.3 m L 10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚。計算公式為清除率d =［A自-（A樣-A樣比）］/A自×100％［8-9］。

1.2.8 刀豆總黃酮對羥自由基的清除實驗 往試管加入2.0 mL 0.2 mmol/L磷酸緩沖液（pH =7.4）、1.2 mL 0.75 mmol/L鄰菲啰啉無水乙醇溶液、1.0 m L樣品液、1.0 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵（新沸水現配），混勻后立即加入0.5 mL 0.05％雙氧水，37℃恒溫水浴鍋中保溫1 h，于510 nm下測定吸光度，重復3次，取平均值。損傷管用51％乙醇液代替樣品液，未損傷管用1 mL 51％乙醇液代替樣品，再用高純水代替0.05％雙氧水溶液，計算公式為清除率E=（A樣-A損）/（A未損-A損）×100％［10-11］。

2 結果與分析

2.1 黃酮類型的鑒別 首先，將刀豆總黃酮提取液圖譜分別與蘆丁和柚皮素對照品溶液的紫外吸收圖譜進行比較，由于柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物，故以柚皮素標準品溶液為二氫黃酮的標準對照品［12］。由圖1可知，藏藥刀豆提取液的紫外吸收掃描圖譜與蘆丁明顯不同，呈現出典型的二氫黃酮類成分特征，結合理化鑒別實驗結果，可知刀豆總黃酮屬二氫黃酮類成分。將其與柚皮素對照品溶液的紫外吸收圖譜比較后發現，兩者的相似程度很高，最大吸收波長都在290 nm處。

2.2 柚皮素標準曲線 以柚皮素質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y=48.035X+0.013 8，r=0.999 7，在0.002～0.032 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取次數的影響 在料液比1∶20，乙醇體積分數50％，超聲功率200 W，超聲時間30 min，超聲溫度50℃的條件下，提取1、2、3、4次。結果，總黃酮提取率隨提取次數的增加而上升，但程度不明顯，由于提取1次后的增加量很少，故確定提取1次。

2.3.2 提取時間的影響 在料液比1∶20，乙醇體積分數50％，超聲功率200 W，超聲溫度50℃的條件下，以不同提取時間進行提取，平行3次，取平均值，結果見圖2。由圖可知，當提取時間超過30 min后，總黃酮提取率已基本不再增加，故確定提取時間為30 min。

圖1　紫外掃描圖譜

圖2　不同提取時間對總黃酮提取率的影響

2.3.3 乙醇體積分數的影響 在料液比1∶20，超聲功率200 W，超聲時間30 min，超聲溫度50℃的條件下，以不同體積分數的乙醇溶液進行提取，平行3次，取平均值，結果見圖3。由圖可知，以50％左右乙醇溶液為溶劑時，總黃酮提取率較高，故選擇45％、50％、55％乙醇進行響應面分析。

圖3　不同乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

2.3.4 料液比的影響 在乙醇體積分數50％，超聲功率200 W，超聲時間30 min，超聲溫度50℃的條件下，以不同料液比進行提取，平行3次，取平均值，結果見圖4。由圖可知，在料液比為1∶20左右時，總黃酮提取率較高，故選擇1∶15、1∶20、1∶25料液比進行響應面分析。

圖4　不同料液比對總黃酮提取率的影響

2.3.5 提取溫度的影響 在料液比1∶20，乙醇體積分數50％，超聲功率200 W，超聲時間30 min的條件下，以不同提取溫度進行提取，平行3次，取平均值，結果見圖5。由圖可知，隨著提取溫度增加，總黃酮提取率在70℃前呈上升趨勢，但在70℃后又呈下降趨勢，故選擇65、70和75℃提取溫度進行響應面分析。

圖5　不同提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.4 響應面設計

2.4.1 Box-Behnken設計與結果 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）這3個最顯著的影響因素作為研究對象，以黃酮得率為響應值，設計Box-Behnken試驗，采用Design Expert7.0軟件分析，結果見表1。經回歸擬合后，得到刀豆黃酮含有量（Y）與各因素的回歸方程為 Y=0.67 +5.125×10-3A+ 0.010B+0.013C+4.250×10-3AB+4.500×10-3AC+ 3.750×10-3BC-0.022A2-0.044B2-0.015C2。

表1　Box-BehnKen設計與結果

2.4.2 模型的方差分析（表2） 由表可知，整個回歸模型的p<0.000 1，達到極顯著水平，表明該模型能很好地描述實驗結果；一次項A、B、C的p均<0.05，為顯著水平，表明3個因素對總黃酮的提取率都有顯著影響；二次項A2、B2和C2的p均<0.000 1，達到極顯著水平；失擬型的p>0.05，水平不顯著，表明該方程有效性良好。

表2　方差分析

2.4.3 響應面分析（圖6～8） 由圖可知，乙醇體積分數和料液比對提取率的影響為明顯的二次拋物線，總黃酮得率隨乙醇體積分數和料液比的增加而迅速上升，有明顯的交互作用，但達到一個峰值后又迅速降低。當乙醇極性隨體積分數增加而改變，直到接近黃酮極性時，有利于黃酮的溶出，同時料液比的增加也給黃酮溶出提供了更多空間。當乙醇體積分數和料液比過大時，黃酮的溶出反而減少。而且，乙醇體積分數和提取溫度，以及料液比和提取溫度對提取率的影響均為明顯的二次拋物線。

圖6　乙醇體積分數和料液比對提取率的影響

2.4.4 提取工藝的確定和驗證 以總黃酮得率范圍中的最低點為出發點，采用快速上升法進行條件優化，得到最佳工藝條件為乙醇體積分數50.88％，料液比1∶20.71，提取溫度72.32℃，總黃酮得率0.675％，即6.75 mg/g。然后，以乙醇體積分數51％，料液比1∶21，提取溫度72.5℃進行3次驗證試驗，測得平均總黃酮得率為0.671％，與理論預測值非常接近。由此可知，該提取條件準確可靠，具有實用價值。

圖7　乙醇體積分數和提取溫度對提取率的影響

圖8　料液比和提取溫度對提取率的影響

2.5 抗氧化活性考察

2.5.1 清除超氧陰離子自由基 藏藥刀豆總黃酮隨著質量濃度增加，清除超氧陰離子自由基的能力逐漸增強，但稍弱于維生素C，見圖9。

圖9　清除超氧陰離子自由基能力的比較

2.5.2 清除羥自由基 藏藥刀豆總黃酮隨著質量濃度增加，清除羥自由基的能力逐漸增強。而且，其在低質量濃度時的清除率高于維生素C，但隨著質量濃度增加，維生素C的清除能力反而勝出，見圖10。

圖10　清除羥自由基能力的比較

3 結論

提取溫度、料液比和乙醇體積分數對藏藥刀豆總黃酮的提取率均有顯著影響，在單因素試驗基礎上，采用Box-Bhenken設計方案，應用Design Expert7.0軟件對所得模型進行分析，得到最佳工藝條件為乙醇體積分數50.88％，料液比1∶20.71，提取溫度72.32℃，總黃酮得率0.675％。然后，以乙醇體積分數51％，料液比1∶21，提取溫度72.5℃進行3次平行驗證試驗，測得平均總黃酮得率為0.671％，與理論預測值非常接近。由此可知，該提取條件準確可靠，具有實用價值。

抗氧化實驗結果表明，藏藥刀豆總黃酮提取物對超氧陰離子自由基（O2-）和羥自由基（·OH）均有較強的清除能力，并與其質量濃度呈正相關性，即抗氧化活性明顯。在生物體內，存在蛋白質、脂肪等諸多能和自由基作用的物質，從而破壞細胞結構和功能，引發生物體產生動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等多種疾病［13］，而黃酮成分具有抗炎、抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血壓等較廣泛的生物活性［14］。因此，本實驗具有較大的應用價值，可為相關產品的開發與利用提供一定參考依據。

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*通信作者：韓泳平（1965—），男，教授，研究方向為民族藥物化學。E-mail：yphan65@tom.com

作者簡介：孔子銘（1988—），男（蒙古族），碩士，研究方向為民族藥物化學。Tel：18081950783，E-mail：370559065@qq.com

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃（2012BAI27B07）；西南民族大學碩士點建設項目（2015XWD-S0703）

收稿日期：2015-08-10

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.044

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1163-05