荷丹片對APOE-/-小鼠氧化應激的影響及對動脈粥樣硬化的干預

于柏青， 周玉娟， 劉春穎， 劉子豪， 許明軒， 曹曉華

（1.河北大學研究生院，河北保定071000；2.河北大學基礎醫學院藥理教研室，河北保定071000；3.河北大學臨床醫學院，河北保定071000；4.滄州市人民醫院，河北滄州061000；5.河北大學附屬醫院，河北保定071000）

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荷丹片對APOE-/-小鼠氧化應激的影響及對動脈粥樣硬化的干預

于柏青1， 周玉娟2 *， 劉春穎2， 劉子豪3， 許明軒4， 曹曉華5

（1.河北大學研究生院，河北保定071000；2.河北大學基礎醫學院藥理教研室，河北保定071000；3.河北大學臨床醫學院，河北保定071000；4.滄州市人民醫院，河北滄州061000；5.河北大學附屬醫院，河北保定071000）

摘要：目的 觀察荷丹片對APOE-/-小鼠血清中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、一氧化氮（NO）、白介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）及主動脈ICAM-1表達的影響。方法 將50只APOE-/-小鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組。給藥12周后全部處死，檢測5組血清ox-LDL、NO、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平及主動脈ICAM-1表達。結果 與對照組相比，模型組血清ox-LDL、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平明顯升高，NO水平明顯降低，主動脈ICAM-1表達上調（p<0.01）；與模型組相比，荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組血清ox-LDL、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平明顯降低，NO水平明顯升高，主動脈ICAM-1表達下調（p<0.01，p<0.05）。結論 荷丹片可降低APOE-/-小鼠血清ox-LDL、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平，升高血清NO水平，下調主動脈ICAM-1表達，從而干預動脈粥樣硬化的發生、發展。

關鍵詞：荷丹片；APOE-/-小鼠；動脈粥樣硬化；氧化低密度脂蛋白；一氧化氮；白介素-6；單核細胞趨化蛋白-1；細胞間黏附分子-1

荷丹片是一種新型調脂純中藥，由荷葉、丹參、補骨脂、番瀉葉及山楂配伍組成，有升清降濁、化痰祛瘀、補益肝腎之功效，可以降血脂，并干預動脈粥樣硬化的發生發展［1-4］。本實驗旨在觀察荷丹片對APOE-/-小鼠血清ox-LDL、NO、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平及主動脈ICAM-1表達的影響，為其干預APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化的機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗藥品、試劑及儀器

1.1.1 實驗藥品和試劑 膽固醇（賽爾克生物公司）。荷丹片（南昌濟順制藥有限公司，批號20130306）；辛伐他汀片（山東方明藥業集團股份有限公司，批號1301033）。ox-LDL、NO、IL-6試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MCP-1試劑盒（美國RB公司）；ICAM-1（美國P&D system公司）；兔抗鼠ICAM-1多克隆抗體、抗兔IgG-HRP（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.2 儀器 TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）；Model680酶標儀（美國BIO-RAD公司）；OlympusBX50光學顯微鏡（日本Olympus公司）；HWS型智能恒溫恒濕箱（寧波東南儀器有限公司）；UV-2000分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及飼養 健康APOE-/-小鼠50只（C57BL/6J背景），雌雄各半，動物合格證號SCXK（京）2013-0002，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所。隨機分為5組，分別為對照組、模型組、荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組，其中對照組正常飲食，其余組高膽固醇（1.25％）繁殖飼料喂養［2］。荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組每只灌胃給藥0.65 g/kg、2.60 g/kg、6 mg/kg，對照組、模型組喂以等容量的生理鹽水，共12周。

1.2.2 取材 給藥第12周后處死小鼠，眼眶取血，分離血清，置于-20℃冰箱中保存。剝離主動脈，在相同部位取1 cm左右主動脈，固定，石蠟包埋，制備連續切片。

1.3 指標檢測

1.3.1 測量ox-LDL、NO、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）雙抗體夾心法，將血清按比例稀釋后加入ox-LDL、IL-6、MCP-1、ICAM-1單克隆抗體包被的酶標板內，再加入酶標記的特異性抗體，孵育后洗去多余酶結合物，加入顯色劑顯色，終止反應，酶標儀在450 nm處測定吸光度。測量NO時，采用硝酸還原酶法，550 nm處0.5 cm光徑比色，測定吸光度。

1.3.2 檢測ICAM-1表達 石蠟切片、脫蠟、水化、3％過氧化氫孵育10 min以滅活內源性酶，微波抗原修復，滴加封閉液反應10 min，加一抗（1∶50～1∶100）置于濕盒，4℃下過夜。再滴加聚合辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，37℃下反應30 min，DAB鏡下控制顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件分析，數據以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析。兩兩組間比較，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnett-T3檢驗，p<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 荷丹片對APOE-/-小鼠血清ox-LDL、NO水平的影響

與對照組相比，模型組ox-LDL水平明顯升高，NO水平明顯降低（p<0.01）；與模型組相比，荷丹片低劑量組、高劑量組、辛伐他汀組ox-LDL水平明顯降低，NO水平明顯升高（p<0.01）；與辛伐他汀組相比，荷丹片低劑量組ox-LDL水平明顯升高，NO水平明顯降低（p<0.01），荷丹片高劑量組與之無顯著差異（p>0.05）。見表1。

表1　荷丹片對APOE-/-小鼠血清ox-LDL、NO水平的影響（±s，n=10）

表1　荷丹片對APOE-/-小鼠血清ox-LDL、NO水平的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較，△△p<0.01；與模型組比較，**p<0.01；與辛伐他汀組比較，##p<0.01

組別　ox-LDL/（μg·mL-1）　NO/（μmol·L-1）對照組7.68±1.08　49.62±5.61模型組　13.43±1.60△△　29.47±3.38△△荷丹片低劑量組　11.48±0.95**##　39.58±5.24**##荷丹片高劑量組　8.62±0.58**　51.69±5.87**辛伐他汀組　8.41±0.55**　53.09±5.99**

2.2 荷丹片對APOE-/-小鼠血清IL-6、MCP-1、ICAM-1水平的影響 與對照組相比，模型組IL-6、MCP-1、ICAM-1水平明顯升高（p<0.01）；與模型組相比，荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組IL-6、MCP-1、ICAM-1水平明顯降低（p<0.05）；與辛伐他汀組相比，荷丹片低劑量組MCP-1、ICAM-1水平明顯升高（p<0.05）；荷丹片高劑量組與之無顯著差異（p>0.05）。見表2。

表2　荷丹片對APOE-/-小鼠血清IL-6、MCP-1、ICAM-1水平的影響（±s，n=10）

表2　荷丹片對APOE-/-小鼠血清IL-6、MCP-1、ICAM-1水平的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較，△△p<0.01；與模型組比較，*p<0.05；與辛伐他汀組比較，#p<0.05

組別　IL-6/ （pg·mL-1）MCP-1/ （ng·dL-1）ICAM-1/ （mg·mL-1）對照組35.03±2.24　 10.87±1.21　 19.84±2.45模型組　44.36±3.58△△26.04±2.75△△32.35±4.26△△荷丹片低劑量組37.24±2.77*　20.96±1.30* #26.58±3.08* #荷丹片高劑量組35.39±1.93*13.19±1.69*21.66±2.81*辛伐他汀組　34.75±3.42*11.25±1.58*20.17±2.74*

2.3 荷丹片對APOE-/-小鼠主動脈ICAM-1表達的影響ICAM-1以棕黃色著色為陽性表達，各組APOE-/-小鼠主動脈均有不同程度的ICAM-1表達。對照組主動脈內、外膜均有ICAM-1表達；模型組主動脈粥樣斑塊內可見ICAM-1大量表達，顏色深；荷丹片低劑量組主動脈斑塊、外膜均有ICAM-1表達，比模型組少；荷丹片高劑量組、辛伐他汀組主動脈內、外膜均有ICAM-1表達，比模型組和荷丹片低劑量組少。見圖1。

各組主動脈平均光密度值分別為0.062 0±0.007 6（對照組）、0.119 0±0.008 8（模型組）、0.091 0±0.007 2（荷丹片低劑量組）、0.069 0±0.005 2（荷丹片高劑量組）、0.072 0±0.008 4（辛伐他汀組）。與對照組相比，模型組主動脈ICAM-1平均光密度值明顯升高（p<0.01）；與模型組相比，荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組主動脈ICAM-1平均光密度值明顯降低（p<0.01）；與辛伐他汀組相比，荷丹片低劑量組主動脈ICAM-1平均光密度值明顯升高（p<0.01）；荷丹片高劑量組與之無顯著差異（p>0.05）。見圖2。

注：與對照組比較，△△p<0.01；與模型組比較，**p<0.01；與辛伐他汀組比較，##p<0.01圖2　各組小鼠主動脈ICAM-1免疫組化染色光密度分析結果

3 討論

APOE-/-小鼠無論正常或高脂喂養，均能自發形成動脈粥樣硬化，而且其從最初的脂肪條紋到復合病變都與人類相似，因此APOE-/-小鼠為研究動脈粥樣硬化的理想模型［3］。荷丹片是我國著名老中醫楊濟生獻方研制的中藥復方，按照化痰降濁、活血化瘀的治療原則，將君藥荷葉、臣藥丹參與補骨脂、佐藥山楂、使藥番瀉葉配伍組方。研究發現，該藥物含生物堿類、丹參醌類、黃酮類等成分，有降血脂的作用，而且君藥荷葉的主要成分為生物堿類和黃酮類，能降低體質量、減少膽固醇與甘油三酯水平，升高HDL-C、LPL、HMG-CoA還原酶活力，并且有明顯的抗氧化作用。已有研究表明［1-4］，荷丹片能降低大鼠血脂、丙二醛（MDA）水平，升高血清超氧化物歧化酶（SOD）水平，從而抑制大鼠動脈粥樣硬化的發生發展。本實驗旨在觀察荷丹片能否通過降低APOE-/-小鼠ox-LDL、IL-6、MCP-1、ICAM-1水平，升高NO水平，減輕氧化應激狀態，抑制炎癥反應，進而發揮抗APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化的作用。

LDL在還原型輔酶Ⅱ氧化酶、髓過氧化酶等作用下，過氧化形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），其形成是動脈粥樣硬化發生的重要步驟，可觸發CD40/CD40L信號，激活炎癥反應［5］，啟動和增快動脈粥樣硬化的發展。除了激活炎癥反應外，ox-LDL還能誘導內皮細胞超氧陰離子的表達，抑制內皮一氧化氮合酶的激活，導致NO減少，從而增強細胞內的氧化應激，內皮功能紊亂［6-7］。NO可抑制LDL的氧化反應，終止脂質過氧化的鏈式擴增反應，也是內皮細胞合成的血管活性物質，能抑制血小板聚集到內皮損傷部位，抑制平滑肌細胞增殖以及白細胞黏附，延緩AS進展［8］。

內皮細胞在ox-LDL刺激下產生MCP-1、白細胞介素-8 （IL-8）等趨化因子，吸引單核細胞遷移入內膜下間隙。MCP-1是一種最重要的趨化因子，對急性冠脈綜合癥有獨立的預后意義，是評價治療后效能的指標［9］。單核細胞進入內膜后在ox-LDL等作用下轉化成巨噬細胞，再通過清道夫受體識別并吞噬ox-LDL誘導泡沫細胞的形成［10］。ox-LDL刺激病變內皮表達更多的黏附分子如ICAM-1、VCAM-1等，介導單核細胞、淋巴細胞等慢性炎細胞黏附于血管內皮細胞并遷移至皮下，促進動脈粥樣硬化的發生發展［11］。

IL-6是炎癥反應最重要的白介素成分，參與動脈粥樣硬化病理過程的各個時期［12］。IL-6誘導肝臟合成急性期蛋白CRP，激活細胞外信號調節激酶（ERK）途徑，促進基質金屬蛋白酶（MMP）的表達，進而促進膠原纖維的降解，形成AS斑塊。Bekkering等［13］研究表明，ox-LDL可以促進IL-6、TNF-α等促炎因子的釋放，它們能抑制內皮細胞NOS表達，促進內皮細胞合成NADPH氧化酶、ICAM-1、VCAM-1等［14］，參與AS的形成和發展。

實驗顯示，荷丹片能降低APOE-/-小鼠血清ox-LDL水平，升高NO水平，抑制脂質過氧化，同時下調血清IL-6、MCP-1、ICAM-1水平以及主動脈ICAM-1表達，減弱炎癥反應，抑制單核細胞聚集，預防動脈粥樣硬化的發生發展，這可能是其干預APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化的機制之一。

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網絡出版日期：2015-09-01

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20150901.1335.004.html

*通信作者：周玉娟（1964—），女，碩士，教授，研究方向為心血管藥理學。Tel：（0312）5075538，E-mail：zyj@hbu.edu.cn

作者簡介：于柏青（1990—），女，研究方向為動脈粥樣硬化。Tel：18233280197

基金項目：河北大學醫學學科專項基金建設項目（2012A3001）

收稿日期：2015-02-09

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.039

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1144-03