斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721 ERK 1/2通路和G2/M期調控蛋白的影響

晏　容， 劉　云， 賀莉芳， 楊雪峰， 劉　流， 李曉飛

（1.遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，貴州遵義563003；3.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州，遵義563003）

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斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721 ERK 1/2通路和G2/M期調控蛋白的影響

晏容1， 劉云2， 賀莉芳1， 楊雪峰3， 劉流1， 李曉飛1

（1.遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，貴州遵義563003；3.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州，遵義563003）

摘要：目的 探討斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）通路和周期相關蛋白的影響。方法 將不同濃度的斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細胞SMMC-7721，免疫印跡法檢測ERK1/2通路和周期相關蛋白表達的變化。結果 與對照組比較，0.895、1.79 μmol/L濃度組的ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯下降，同時周期相關蛋白Cdc25C、Cdc2表達顯著下調。結論 推測斑蝥素酸鎂可能是通過抑制ERK1/2通路，進而調控Cdc25C、Cdc2的表達下調，使細胞發(fā)生G2/M期阻滯，最終誘導細胞凋亡。

關鍵詞：斑蝥素酸鎂；人肝癌細胞SMMC-7721；ERK1/2通路；Cdc25C；Cdc2

課題組前期通過同位素標記相對和絕對定量（ITRAQ）技術研究斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2蛋白質組差異表達分析發(fā)現(xiàn)，ERK1/2表達量呈顯著下調趨勢。提示ERK1/2通路可能在斑蝥素酸鎂抑制肝癌細胞生長的機制中發(fā)揮重要作用。研究表明，ERK1/2信號通路與多種細胞周期蛋白的變化有關［1］，前期研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鎂在體內外均可抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖，并能誘導肝癌細胞凋亡，其凋亡的發(fā)生與G2/M期阻滯有關。具體機制是否由于ERK1/2信號通路發(fā)生異常進而調控G2/M期周期相關蛋白出現(xiàn)變化，最終導致G2/M期發(fā)生阻滯，目前尚不清楚。因此，本研究選取人肝癌細胞SMMC-7721作為靶細胞，探討斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721 ERK1/2通路和G2/M期調控蛋白的影響，初步明確斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721的抗癌機制。

1 材料

1.1 斑蝥素酸鎂的制備［2］在50 mL的三角燒瓶中加入斑蝥素純品1 g，加入30 mL三氯甲烷溶液，加熱使其溶解，同時取氫氧化鎂0.2 g加30 mL蒸餾水制成懸濁液；將氫氧化鎂懸濁液加入到溶解斑蝥素的三氯甲烷溶液中，磁力攪拌24 h后加熱到60℃，將三氯甲烷揮干，過濾，得白色懸浮液；置烘箱中濃縮，干燥，得白色結晶粉末；將30 mL的三氯甲烷加入到白色結晶粉末中，加熱到40℃恒溫2 h，使斑蝥素溶解，過濾，干燥，得白色結晶粉末即為斑蝥素酸鎂純品，其含有量在90％以上。

1.2 肝癌細胞株 人肝癌細胞SMMC-7721購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產品；南美胎牛血清、胰蛋白酶為美國Hyclone公司產品；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；Anti-Cdc25C antibody ［TC-19］、Anti-ERK1 +ERK2 antibody、Anti-ERK1（phospho Y204）+ERK2（phospho Y187）antibody購自英國Abcam公司；Cdc2 p34 Antibody（17）購自美國Santa公司；羊抗兔HRP標記二抗、羊抗小鼠HRP標記二抗購自碧云天生物技術有限公司；硝酸纖維素膜、發(fā)光液購自美國Millipore公司；其他常用生化試劑均為國產分析純。

1.4 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；mini protean 3 cell電泳儀購自美國BIO-RAD公司；SP-9型電轉儀購自大連競邁生物科技有限公司。

2 方法

2.1 肝癌細胞的培養(yǎng) 參照文獻［3］進行細胞培養(yǎng)，最終將細胞懸液按1×105/mL密度接種于6孔板中，37℃、5％CO2培養(yǎng)。

2.2 實驗分組 培養(yǎng)20 h后棄上清，再加入配置好的斑蝥素酸鎂，藥物終濃度為1.79、0.895、0.224 μmol/L，對照組加等量的培養(yǎng)基；37℃、5％CO2培養(yǎng)48 h。

2.3 Western blot法 棄上清，細胞用預冷PBS洗2次；每6孔板加入250 μL的RIPA細胞裂解液（含終濃度為1 mmol/L的PMSF蛋白酶抑制劑），冰上裂解20 min；細胞充分裂解后，收集細胞于EP管中，4°C、12 000 r/mim離心10 min；收集上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。20 μg提取的蛋白樣品行SDS-PAGE電泳后轉膜，封閉后加入按抗體說明書推薦比例稀釋后的一抗稀釋液中，4℃孵育過夜，PBS洗膜3次，每次10 min，加入二抗工作液，PBS洗2次，每次10 min，浸于適量ECL化學發(fā)光試劑中1 min，取出室溫條件下干燥并用保鮮膜包置于暗盒中，壓片曝光。利用Quantity One軟件進行灰度分析。磷酸化蛋白的相對含有量=磷酸化目的蛋白條帶灰度值/總目的蛋白條帶灰度值；蛋白的相對含有量=目的蛋白的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差（x±s）表示，SPSS 13.0軟件包進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 斑蝥素酸鎂對ERK1/2的蛋白表達以及蛋白磷酸化表達的影響 采用Western blot檢測不同濃度斑蝥素酸鎂作用于SMMC-7721肝癌細胞后，ERK1/2的蛋白表達以及蛋白磷酸化表達。結果顯示，0.224 μmol/L濃度組ERK1/2蛋白的磷酸化水平與對照組比較，沒有明顯變化（p> 0.05）；0.895、1.79 μmol/L濃度組ERK1/2蛋白的磷酸化水平與對照組比較，明顯下調（p <0.01）；但總的ERK1/2蛋白表達量沒有發(fā)生變化（圖1～2）。提示低濃度組的斑蝥素酸鎂對ERK1/2通路的影響不明顯，但是當濃度達到0.895 μmol/L時ERK1/2通路受到顯著抑制。

1.對照組 2.斑蝥素酸鎂（0.224 μmol/L）組 3.斑蝥素酸鎂（0.895 μmol/L）組 4.斑蝥素酸鎂（1.79 μmol/L）組圖1　ERK 1/2蛋白以及蛋白磷酸化的表達

注：與對照組比較，**p<0.01圖2　斑蝥素酸鎂對ERK1/2蛋白磷酸化表達的影響

3.2 斑蝥素酸鎂對Cdc25C蛋白表達的影響 斑蝥素酸鎂對Cdc25C蛋白表達的影響如圖3～4所示。0.224 μmol/L濃度組Cdc25C蛋白表達與對照組比較，沒有明顯變化（p>0.05）；0.895、1.79 μmol/L濃度組Cdc25C蛋白表達與對照組比較，明顯下調（p<0.01）。

1.對照組 2.斑蝥素酸鎂（0.224 μmol/L）組 3.斑蝥素酸鎂（0.895 μmol/L）組 4.斑蝥素酸鎂（1.79 μmol/L）組圖3　Cdc25C蛋白的表達

注：與對照組比較，**p<0.01圖4　斑蝥素酸鎂對Cdc25C蛋白表達的影響

3.3 斑蝥素酸鎂對Cdc2蛋白表達的影響 斑蝥素酸鎂對Cdc2蛋白表達的影響如圖5～6所示。與對照組比較，0.224 μmol/L濃度組Cdc2蛋白表達沒有明顯變化（p> 0.05），0.895、1.79 μmol/L濃度組Cdc2蛋白表達與對照組比較，明顯下調（p<0.01）。

1.對照組 2.斑蝥素酸鎂（0.224 μmol/L）組 3.斑蝥素酸鎂（0.895 μmol/L）組 4.斑蝥素酸鎂（1.79 μmol/L）組圖5　Cdc2蛋白的表達

注：與對照組比較，**p<0.01圖6　斑蝥素酸鎂對Cdc2蛋白表達的影響

4 討論

細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是上世紀80年代末期發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，是傳遞絲裂原信號的信號蛋白［4］。蛋白ERK1/2是細胞內重要的信號轉導通路，屬于MAPK家族成員，是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，ERK1/2參與細胞的生長、發(fā)育、分裂等一系列生理過程，其異常表達在細胞的惡性轉化和腫瘤的發(fā)生中起重要作用［5-6］。已在肝癌、前列腺癌等多種腫瘤中，檢測到ERK1/2信號通路異常明顯活化，其可激活一系列胞質蛋白，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。國外學者David等［8］發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中，ERK1/2的磷酸化水平顯著增加，抑制其磷酸化后，卵巢癌細胞的生長受到抑制。本實驗發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細胞SMMC-7721后，低濃度組的斑蝥素酸鎂對ERK1/2蛋白磷酸化水平沒有影響，隨著濃度的增加ERK1/2蛋白磷酸化水平逐漸下調，而總體的ERK1/2蛋白表達卻無明顯變化。提示ERK1/2通路的抑制可能在斑蝥素酸鎂抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長中發(fā)揮作用。

G2/M期是細胞增殖的主要調控點［9］。其中Cdc2是特異性調控G2/M期的細胞周期蛋白依賴激酶，是G2/M期調控的關鍵，其活性受到多種因子的調控。其中，Cdc25C是調節(jié)Cdc2活性的關鍵酶，能夠使Cdc2的p-Cdc2 （Tyr15），Tyr14脫磷酸化從而激活Cdc2，激活的Cdc2使細胞從G2期進入M期。同時，ERK1/2又與多種細胞周期蛋白的變化有關，如Cdc25C的活性受ERK1/2的調控，在G2/M期ERK1/2激酶直接激活Cdc25C［10］，相反ERK1/2的耗竭致使Cdc25C表達下調［11］。Ye等［12］研究表明，氧化吲哚的衍生物XJW20通過下調ERK1/2的磷酸化水平，致使Cdc25C活性下降引起Cdc2表達降低，最終細胞發(fā)生G2/M期阻滯。本實驗與Ye等的研究結果相似。因此，我們推測斑蝥素酸鎂可能是通過抑制ERK1/2通路，進而調控Cdc25C活性下降導致Cdc2的表達下調，使細胞發(fā)生G2/M期阻滯，最終誘導細胞凋亡。

參考文獻：

［1］ 騰振平.ERK1/2信號通路在Jurkat T細胞增殖調控中的作用［D］.廣州：暨南大學，2007.

［2］ 李曉飛.斑蝥素酸鎂及其制備工藝：中國，ZL201110149288.5 ［P］.2013-04-17

［3］ 晏 容，劉 云，朱欣婷，等.斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721及其裸鼠皮下移植瘤的影響［J］.應用昆蟲學報，2015，52（2）：477-485.

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作者簡介：晏 容（1978—），女，碩士，副教授，研究方向為昆蟲資源開發(fā)與利用。E-mail：yanr3725881994@sina.com

基金項目：國家自然科學基金（81560669）；貴州省科技廳社會發(fā)展攻關項目（黔科合SY字［2012］3082）；貴州省科技廳社會發(fā)展攻關項目（黔科合SY字［2011］3031）；匯川區(qū)科技計劃項目（E-114）

收稿日期：2015-03-31

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.038

中圖分類號：R966

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1141-03