ICP-MS法測定蛹蟲草菌絲體干粉中12種金屬元素

王　晶， 黃偉雄， 梁曉艷， 胡軍高， 梁旭霞*

（1.廣東省疾病預防控制中心，廣東廣州511430；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西南寧530011）

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ICP-MS法測定蛹蟲草菌絲體干粉中12種金屬元素

王晶1， 黃偉雄1， 梁曉艷2， 胡軍高1， 梁旭霞1*

（1.廣東省疾病預防控制中心，廣東廣州511430；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西南寧530011）

摘要：目的 建立電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法測定蛹蟲草CordycePsmilitaris菌絲體干粉中鉻（Cr）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（As）、銀（Ag）、鎘（Cd）、銻（Sb）、鋇（Ba）、鉛（Pb）的含有量。方法 濕法消解處理樣品后，ICP-MS法測定其中12種金屬元素的含有量。結果 12種金屬元素的檢出限較低，相關系數均>0.999 2。經凍干櫸木葉粉和茶葉驗證，該方法準確度和精密度良好。結論 蛹蟲草菌絲體干粉中的金屬元素均符合相關國家標準。

關鍵詞：蛹蟲草菌絲體；干粉；金屬元素；ICP-MS

蛹蟲草CordycePsmilitaris是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目等昆蟲蛹體上，形成一種蟲或蛹與菌的結合體，在生物分類學上歸屬于真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、球殼菌目、麥角菌科、蟲草屬［1］。冬蟲夏草與蛹蟲草都是我國傳統名貴中藥材，前者屬于高海拔地區特有的珍貴物種，資源緊缺、價格高昂，而后者與冬蟲夏草同屬異種，分布相對廣泛。兩者的化學成分、藥用功能都非常相似，但蛹蟲草主要藥用活性成分（如蟲草素、腺苷等）的含有量高于冬蟲夏草［2-3］，而且易于人工栽培，故被選為冬蟲夏草的最佳替代品。

蛹蟲草已被國家批準為新資源食品［4］，因此對其質量要求、安全性以及有害成分的控制提出了新的要求。隨著我國工業發展，環境污染狀況日益嚴峻，野生蛹蟲草的生長受環境（土壤、氣候、供肥條件等）影響較大，質量不穩定。此外，其具有較強的環境重金屬富集能力［5-8］，并影響其藥用活性成分的含有量［9-10］。現有研究大多關注于蛹蟲草的藥用活性成分及其影響因素，但鮮有與藥食兩用安全性有關的重金屬種類及含有量分布的報道。因此，本實驗利用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）儀測定其中鉻（Cr）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（As）、銀（Ag）、鎘（Cd）、銻（Sb）、鋇（Ba）、鉛（Pb）的含有量，為深入了解重金屬元素在蛹蟲草菌體內的分布和作用規律提供技術支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 7700X電感耦合等離子體質譜儀，包括MassHunter工作站軟件（美國Agilent公司）；Direct-Q3超純水處理系統（德國Merck Millipore公司）；高純氬氣（99.999％，廣州氣體廠有限公司）；DS-360智能石墨消解儀（常溫～210℃，廣州格丹納儀器有限公司）；精密微量移液器（10、20、50～100、200 μL，德國Eppendorf公司）；XPE204電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；圓底硬質玻璃消化管（50 mL）；塑料試管（15 mL，美國BD公司）。

1.2 試劑 蛹蟲草菌絲體干粉共3批，批號分別為150101、150102、150103（廣東某保健品公司）。硝酸為優級純（德國Merck公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

凍干櫸木葉粉（編號BCR-100，30 g/瓶，歐洲參考物質研究所與測量委員會聯合研究中心）；茶葉（編號INCT-TL-1，50 g/瓶，波蘭核化學與技術研究院）。

安捷倫多元素混合標準溶液［基體為10％ HNO3，其中鐵（Fe）元素質量濃度為1 000 μg/mL，鉻（Cr）、錳（Mn）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（As）、銀（Ag）、鎘（Cd）、銻（Sb）、鋇（Ba）、鉛（Pb）元素質量濃度均為10 μg/mL，編號5183-4688］；安捷倫多元素內標混合液［基體為5％HNO3，含有鋰（Li）、鈧（Sc）、鍺（Ge）、釔（Y）、銦（In）、鋱（Tb）、鉍（Bi）7種元素，其質量濃度均為10 μg/mL，編號5183-4680］；安捷倫多元素ICP-MS儀器調諧溶液［基體為2％HNO3，含有鋰（Li）、釔（Y）、鈰（Ce）、鉈（Tl）、鈷（Co）5種元素，其質量濃度均為10 ng/mL，編號5184-3566］。

2 方法

2.1 樣品消化 分別精密稱取各批蛹蟲草菌絲體干粉樣品4份（含平行樣品），稱樣量分別為0.417 8、0.428 5、0.427 7和0.425 8 g，置于50 mL圓底硬質玻璃消化管中，并加入優級純濃硝酸10 mL，將消化管置于智能石墨消解儀中，低溫預消解至樣品全部溶解，升溫至120℃，維持4 h，再升溫至160℃消解，若溶液出現炭化，可適當補加硝酸繼續消化，直至樣品清澈透明，呈淡黃色，最后180℃趕酸至約1 mL［11-12］。同時，制備樣品空白，以凍干櫸木葉粉與茶葉兩種有證參考物質為質量控制樣本，同法處理，并制備質控樣本。所有樣品消化液均轉移至15 mL BD塑料試管中，少量純水多次洗滌消化管，合并洗滌液與消化液，最后定容至10 mL，搖勻，待測。

2.2 溶液配制

2.2.1 多元素混合標準曲線溶液配制 5％HNO3將安捷倫多元素混合標準溶液逐級稀釋成系列標準曲線溶液，質量濃度分別為Fe 0.00、0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 μg/mL，Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Pb 0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL。

2.2.2 混合內標使用液配制 5％HNO3將10 μg/mL Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi安捷倫內標混合液稀釋為1.0 μg/mL內標使用液。

2.2.3 ICP-MS儀器調諧使用液配制 5％HNO3將10 ng/mL Li、Y、Ce、Ti、Co安捷倫多元素ICPMS儀器調諧溶液稀釋為1 ng/mL質譜調諧使用液。

2.3 ICP-MS儀器實驗條件 測定各元素時，均采用氦氣碰撞消除多原子離子干擾模式，各主要儀器操作條件和參數見表1。將標準系列、樣品空白、樣品溶液、質控樣品依次上機進行檢測，采集數據，進行計算。

表1　操作條件及參數Tab.1 Operation conditions and parameters

2.4 方法學技術參數

2.4.1 檢出限與定量限測定 同時制備21份濕法消化的樣品空白溶液，定容后上機測定對應金屬元素含有量，依據食品衛生檢驗方法（理化部分）注解［13］及《中國藥典》2010版［14］有關規定，計算方法檢出限與定量限。

2.4.2 標準工作曲線繪制 將系列質量濃度標準溶液上機測定，以各元素與虛擬內標每秒計數（CPS）的比值為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準工作曲線。

2.4.3 回收率與精密度測定 精密稱取平行樣品12份，先測定3份來計算各元素的本底含有量，剩余9份按低、中、高3個不同梯度分別加入多元素標準溶液，每3份對應1個梯度，同時消化并定容，上機測定各元素質量濃度，并計算回收率與精密度［13-15］。

2.4.4 質量控制 同時消化蛹蟲草菌絲體干粉樣品、3份茶葉及3份凍干櫸木葉粉有證參考物質，同法測定，計算各元素平均值與相對標準偏差，并與參考證書中的標示值進行比較，結合相對標準偏差來分析方法準確性與精確度。

2.4.5 方法穩定性實驗 將消化定容好的樣品溶液于24 h內連續測定3次。放置1個月后，分別在第1天、第2周、第3周用同樣的儀器分析條件進行測定，分別計算平均值與相對標準偏差，考察方法穩定性。

2.5 樣品測定 根據建立的分析方法和標準工作曲線，測定上述空白、樣品和質控溶液中各金屬元素的含有量，含平行樣的批次樣本測定結果取其平均值。

3 結果

3.1 方法學參數

3.1.1 檢出限與線性范圍 各金屬元素的方法檢出限、定量限以及相關系數見表2，發現各元素的檢出限都較低，方法靈敏度高，相關系數均大于0.999 2，符合分析要求［15］。

表2　檢出限與線性范圍Tab.2 Detection lim its and linear ranges

3.1.2 方法回收率試驗 低、中、高3個梯度溶液的加樣回收率分別為90.4％～103％、89.9％～103％、91.6％～104％，達到分析要求［15］，具體見表3。

3.1.3 精密度試驗 在低、中、高3個梯度溶液中，各元素RSD最大值分別為2.1％、2.4％、1.6％，表明儀器精密度良好。

3.1.4 穩定性試驗 日內誤差與日間誤差的RSD均在0.5％～3.1％之間，表明該方法穩定性良好。

3.1.5 有證參考物質（質控樣品）的驗證 凍干櫸木葉粉和茶葉檢測結果顯示，該方法回收率較高。金屬元素含有量大于100 mg/kg時，回收率為92.2％～102％；在1～100 mg/kg之間時，回收率為92.8％～104％；在0.1～1 mg/kg之間時，回收率為94.7％～100％；小于0.1 mg/kg時，回收率為85.8％～100％，并且各元素RSD均較小，表明該方法能滿足分析要求，具體見表4。

表3　加樣回收率試驗結果（n=3）Tab.3 Results of recovery tests（n=3）

表4　質控樣品檢測結果Tab.4 Determ ination results of quality control samples

3.2 樣品檢測結果 對3批蛹蟲草菌絲體干粉中12種金屬元素的含有量進行檢測，結果見表5，發現均符合中藥或食品相關限量指標［16］。

表5　樣品檢測結果Tab.5 Determ ination results of samp les

4 討論

近年來，我國環境重金屬污染形勢嚴峻，對野生中藥材的安全使用構成極大威脅［18-19］。現有研究結果表明，環境中的重金屬可通過食物鏈的傳遞，經多渠道被人體攝入、蓄積，并引發健康危害效應［20-21］。國內外對中藥材的安全性評價高度重視，以其所含金屬的總含有量進行評價，并對幾種毒性較大的鉛、砷、鎘、汞元素制定了嚴格的限量標準，但對常見金屬元素含有量的控制及評價研究相對較少，不利于提高中藥材質量的總體控制水平。

蛹蟲草屬真菌類中藥材，能富集環境中的重金屬元素［5-6］，其所含重金屬的含有量可影響藥用活性成分的生物合成，從而改變藥效。例如，鋅可抑制蟲草素及腺苷合成［9］；錳可促進蟲草素合成，并抑制腺苷合成［10］；六價鉻對部分大型真菌（如秀珍菇、豬肚菇）的菌落直徑以及菌絲體干重有先增后減的作用［22］，但對蛹蟲草生長作用的研究相對較少。蛹蟲草因富含超氧化物歧化酶（SOD）而具有抗炎、抗氧化等功效，根據金屬輔基不同，主要分為3種，即Cu/Zn SOD、Fe-SOD、Mn-SOD。杜琳等［23］指出，深層發酵蛹蟲草菌絲體中主要是Cu/Zn SOD型，但鮮有其對銅的富集作用，以及對活性SOD合成影響的研究。其他金屬元素（如鐵、鎳、銻、鋇、銀等）都曾被報道存在一定的生態風險［24-28］，但其與蛹蟲草相互作用的研究還比較欠缺。現有的元素分析手段大多為單元素測定，檢測技術的制約是導致目前研究效率低下的重要原因之一，故迫切需要建立一種效率高、準確度好的多元素同時測定方法。

電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）技術是一種多元素痕量分析技術，相對于光譜法，其具有抗干擾能力強、檢測限低、靈敏度高、線性范圍寬等優點，可應用于不同類型藥品的檢測與質量控制［16，29-32］。本實驗選擇濕法消化結合ICP-MS儀，對蛹蟲草菌絲體干粉進行重金屬元素含有量分析，檢測效率高，消化效果好，可操作性強。結果，蛹蟲草菌絲體干粉中錳、鋅、鐵、銅、鋇等元素的含有量較高，這與文獻報道其富含硒、鋅、錳等元素的特性一致，而且該方法的準確度、精密度等指標都符合檢測技術要求。查閱相關限量標準發現，蛹蟲草中金屬元素的含有量符合國內中藥或食品相關限量規定，也符合美國藥典標準。

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［飲片炮制］

Determ ination of twelvemetal elements in dry powder of CordycePsm ilitaris m ycelium by ICP-MS

WANG Jing1， HUANGWei-xiong1， LIANG Xiao-yan2， HU Jun-gao1， LIANG Xu-xia1 *
（1.Guangdong p rovincial Center for Diseasep revention and Control，Guangzhou 511430，China；2.RuiKang HosPital Affiliated to GuangxiUniversity of Chinese Medicine，Nanning 530011，China）

ABSTRACT：AIM To establish an inductively coupled plasma-mass spectrometry（ICP-MS）method for determing the contents of Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，As，Ag，Cd，Sb，Ba and Pb in dry powder of CordycePsmilitaris mycelium.METHODS After the sampleswere treated with wet digestion，the contents of twelvemetal elements were determined by ICP-MS.RESULTS The detection limits of twelvemetal elements were low，whose correlative coefficientswere allmore than 0.999 2.Themethod validation was performed on frozen-beech leaf powder and tea leaveswith good accuracy and precision.CONCLUSION All themetal elements in dry powder of CordycePs militaris mycelium accord with related national standards.

KEY WORDS：CordycePsmilitaris mycelium；dry powder；metal elements；ICP-MS

*通信作者：梁旭霞（1972—），女，博士生，主任技師，研究方向為化學污染物監測與風險評估。E-mail：liangxuxia@126.com

作者簡介：王 晶（1984—），男，碩士生，主管技師，研究方向為元素分析毒理學。E-mail：wjgdcdc@126.com

基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金（A2015214）

收稿日期：2015-11-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.025

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1083-05