HPCE法研究土鱉蟲鎮痛作用與其指紋圖譜的關系

陳　昭， 陳偉韜， 羅文匯， 畢曉黎，2 *

（1.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州510405）

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HPCE法研究土鱉蟲鎮痛作用與其指紋圖譜的關系

陳昭1， 陳偉韜1， 羅文匯1， 畢曉黎1，2 *

（1.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州510405）

摘要：目的 建立高效毛細管電泳（HPCE）法研究土鱉蟲EuPolyPhaga seu SteleoPhaga鎮痛作用與其指紋圖譜的關系。方法 分析采用熔融硅膠毛細管（75 μm，30 cm×21 cm）；10 mmol/L硼砂（pH=9.7）為緩沖液；進樣電壓5 kV10 s；分離電壓15 kV；檢測波長214 nm。然后，通過醋酸致小鼠扭體實驗來探索各組分對鎮痛作用的影響。結果 土鱉蟲指紋圖譜中有7個特征峰，其中有2個為尿囊素與氯氮卓。兩者的含有量與土鱉蟲的鎮痛作用成正比關系。結論 各批次土鱉蟲樣品間存在差異，其鎮痛作用可用于質量評價。

關鍵詞：土鱉蟲；鎮痛作用；指紋圖譜；尿囊素；氯氮卓；HPCE

土鱉蟲為動物藥，其所含成分多為蛋白、核酸、生物堿等，其中以蛋白、生物堿、核酸及其衍生物為主［8］。然而，限于目前技術條件及新藥質量標準研究現狀，仍然難以對上述化合物進行逐一鑒別和含有量測定，《中國藥典》2010年版“土鱉蟲”項下僅收載了性狀、顯微鑒別與薄層鑒別。同時，由于土鱉蟲中多數成分存在分子量大、極性高或結構相似等特征，HPLC等傳統分析技術僅能檢測其中一小部分，不能準確反映該藥材與功效相關的質量信息［9］。

高效毛細管電泳（HPCE）技術是在高壓電場作用下，帶點組分隨著電場方向遷移的一種分離分析方法［10-11］，由于這種分離在狹小空間內進行（25～200 μm內徑，30～70 cm總長的毛細管），加之緩沖液的液流受電場推動而呈平面型，故具有較高的柱效。此外，待測物在該模式下由于帶電量的不同，可導致遷移速率的差異，進而實現分離，而且受分子質量與極性影響相對較小。因此，根據土鱉蟲中主要化合物的理化特性與結構特征，采用HPCE法建立指紋譜所得的化合物信息更為全面與準確。另外，基于HPCE法的土鱉蟲藥材指紋圖譜研究雖已見諸報道［12］，但對其中大量化合物信息及其與鎮痛療效之間的關系仍未涉及。

目前，市場上的土鱉蟲藥材不但功效活性存在差異，而且其藥材基原也存在較大區別，而藥典及現有的分析方法在藥材質量控制、藥材基原研究及功效評價上仍存在較大局限性。因此，有必要尋找更為適宜的分析測定方法用于土鱉蟲藥材指紋圖譜的建立，并在此基礎上，更為客觀地評價不同產區、批次藥材的療效差異，同時探索導致這些差異的物質基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 3DCE高效毛細管電泳儀，配備DAD檢測器及Chemstation工作站（美國Agilent公司）；Thermo TSQ Quantum液相色譜-質譜聯用儀（美國Thermo Fisher公司）；XS205DU電子分析天平、pH計（瑞士Mettler-Toledo公司）；超聲儀（昆山科學儀器廠）；毛細管（河北永年瑞灃色譜器件有限公司）。

1.2 試劑和試藥 硼砂、磷酸二氫鈉（德國Sigma-Aldrich公司）。土鱉蟲樣品分別購自廣東省各大醫藥公司，2個來源，共5批，經廣東省中醫藥工程技術研究院劉法錦研究員鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉EuPolyPhaga sinensis Walker、金邊土鱉OPisthoPlata orientalis Buron或冀地鱉StelePhaga Plancyi Boleny。

2 方法與結果

2.1 對照品和供試品溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取土鱉蟲0.2 g，置于100 mL錐形瓶中，加入20％乙醇50 mL，超聲30 min，過濾，取濾液25 mL，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取土鱉蟲2.0 g，按“2.1.1”項下方法處理，即得。

2.2 毛細管電泳分析條件 熔融硅膠毛細管色譜柱（75 μm，30 cm×21 cm）；緩沖液10 mmol/L硼砂（以磷酸二氫鈉調節pH至9.7）；檢測波長327 nm；進樣電壓5 kV10 s；分離電壓15 kV；柱溫25℃。

2.3 HPCE指紋圖譜測定 取6批藥材，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進行測定，選取其中響應值較大、共同存在的色譜峰作為監控指標峰，用于建立指紋圖譜，見圖1和表1。與地鱉和冀地鱉進行比對后，確定其中7個成分作為質量標準的候選指標。

2.尿囊素 3.氯氮卓 1、4～7未知2.allantoin 3.chlordiazepoxide 1，4 -7 unknown圖1　土鱉蟲HPCE圖譜Fig.1 HPCE chromatograms of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga

2.4 活性成分鑒別 根據文獻調研結果可知，在最優HPCE條件下，土鱉蟲指紋圖譜中的7個特征峰與對照品和保留時間比對，確認峰2為尿囊素。另外田君鵬［13］報道，土鱉蟲中含有生物堿類成分氯氮卓，經與對照品比對后，確認峰3為氯氮卓。

表1　不同來源土鱉蟲中指標成分峰面積Tab.1 PeaK areas of index constituents in EuPolyPhaga seu SteleoPhaga from different sources

為進一步對各特征峰進行鑒定，本實驗將藥材提取液進行LC-MS分析。正、負離子模式下全掃描；電壓3 000 V（負離子模式下-2 500 V）；汽化溫度300℃；毛細管溫度300℃；鞘氣壓力207 kPa；輔氣壓力69 kPa。正離子模式下，以0.1％甲酸-乙腈（30∶70）為流動相；負離子模式下，以10 mmol/L乙酸胺-乙腈（30∶70）為流動相，觀察60 min內出峰情況，然后與文獻進行比對。結果，僅正離子模式下m/z=299的峰可與文獻［11］報道的化合物信息一致，而其他化合物因未有對照品而無法用HPCE進行確認。由于目前僅能獲得峰2與峰3的對照品，故本實驗選取兩者作為土鱉蟲藥材的指標性成分。

2.5 土鱉蟲指標性成分含有量測定

2.5.1 標準曲線和線性關系 精密稱取尿囊素與氯氮卓對照品各10.0 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，即得含兩者質量濃度均為1.0 mg/mL的對照品溶液。精密量取適量，置于10 mL量瓶中，逐級稀釋，得質量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/mL的對照品溶液，在“2.2”項條件下進行測定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標（y），質量濃度為（x），計算尿囊素標準曲線為y= 2.045 6x+2.359 5（r=0.999 6），氯氮卓為y= 2.309 3x+6.666 3（r=0.999 4）。結果顯示，該方法線性關系良好，可在5～200 μg/mL范圍內對兩者進行準確定量。

2.5.2 精密度與回收率

2.5.2.1精密度的測定 精密吸取“2.5.1”項下50 μg/mL的混合對照品溶液1 μL，在“2.2”項條件下進行測定，記錄峰面積，連續測定6次。結果，2個指標性成分的峰面積RSD分別為1.3％和1.7％，表明儀器精密度良好。

2.5.2.2 回收率的測定 精密稱取含有量已知的土鱉蟲藥材0.2 g，共9份，分為低、中、高3個質量濃度組，每組3份。加入一定量1 mg/mL的混合對照品溶液（低、中、高質量濃度分別取800、1 000、1 200 μL），按“2.1”項下方法進行處理，尿囊素和氯氮卓質量濃度均為36～44 μg/mL（以該批藥材制成供試品后，尿囊素質量濃度約為20 μg/mL，氯氮卓質量濃度約為19 μg/mL計）的溶液，在“2.2”項條件下進行測定，平行3次，計算回收率，結果見表2。由表可知，該方法回收率良好，能夠對土鱉蟲藥材進行準確定量。

表2　回收率與精密度測定結果（n=3）Tab.2 Determ ination results of recoveries and precisions （n=3）

2.5.3 不同來源土鱉蟲藥材含有量測定 精密稱取不同來源的土鱉蟲藥材0.2 g，按“2.1”項下方法進行處理，在“2.2”項條件下進行測定，平行3次，記錄峰面積，并計算含有量，結果見表3。

2.6 藥理實驗 采用醋酸致小鼠扭體實驗，分為對照組、化藥（對乙酰氨基酚）組和土鱉蟲藥材組，其中土鱉蟲藥材組又根據藥材不同批次分為5組，每組5只，通過觀察扭體次數來評價鎮痛效果，結果見圖2。由圖可知，金邊土鱉蟲組的鎮痛作用最為顯著，其中組分2與3的峰面積對其有顯著影響（p<0.05）。

表3　含有量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determ ination（n=3）

圖2　藥理實驗結果Fig.2 Results of pharmacological experiments

3 討論與結論

3.1 提取方法優化 由于土鱉蟲藥材中成分較多，而且結構、理化性質差異較大，故本實驗考察了不同提取溶劑、比例及超聲時間下7個共有峰的總面積，同時規定，各條件下所得峰面積不得低于該峰平均數的20％，確定最優提取條件。結果，采用20％乙醇，超聲提取30 min時提取效率最高。根據電泳條件可知，指紋圖譜中的共有峰很可能為生物堿類化合物，由于在該溶劑比例下，藥材中所含的化合物更易于溶出，故最終采用這一提取條件。3.2 譜效關系初步研究 將藥理實驗結果與HPCE指紋圖譜中各特征峰的峰面積進行綜合比對，可知土鱉蟲鎮痛作用與尿囊素和氯氮卓（峰2和峰3）的含有量成正比關系，可能是因為兩者具有鎮痛、促進皮膚潰瘍面和傷口愈合以及生肌等生物活性。因此，在制定土鱉蟲質量標準時，可考慮以尿囊素及氯氮卓為活性成分，并通過測定其含有量來評估藥材質量的優劣。

3.3 結論 本實驗采用HPCE法，結合藥效學試驗，對土鱉蟲鎮痛作用的機理與物質基礎進行了初步探索，同時根據文獻調研及實驗結果，確定尿囊素和氯氮卓這2個化合物作為指標性成分。該方法快速、準確、高效，并且以療效為導向，可作為藥材標準的參考與補充，同時也為動物藥的研究及質量控制提供了借鑒。但是，由于該類藥物存在成分復雜、結構與理化性質特異、功效多樣等特點，故仍需要在后續研究中對所得特征峰作進一步確認。

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Relationship between the analgesia effect and fingerprint of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga by HPCE

CHEN Zhao1， CHENWei-tao1， LUOWen-hui1， BIXiao-li1，2*
（1.Guangdong p rovincial Research Institute of Traditional ChineseMedicineManufacturing Technology，Guangzhou 510095，China；2.Guangzhou University of ChineseMedicine，Guangzhou 510405，China）

ABSTRACT：AIM To establish a high performance capillry electrophoresis（HPCE）method for investigating the relationship between the analgesia effect and fingerprint of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga.METHODS The analysis was performed on fused silica capillary（75 μm，30 cm×21 cm），buffer was 10 mmol/L borax（pH= 9.7），inject voltage was 5 kV10 s，separation voltage was 15 kV，and detection wavelength was set at 214 nm. Then the influences of various constituents on analgesia effect were studied by frequency body torsion caused by acetic acid in mice.RESULTS There were seven characteristic peaks in the fingerprint of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga，two ofwhich were allantoin and chlordiazepoxide.The contents of these two constituentswere proportional to the analgesia effect of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga.CONCLUSION There are differences among various batches of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga samples，whose analgesia effect can be used for the quality control.

KEY WORDS：EuPolyPhaga seu SteleoPhaga；analgesia effect；fingerprint；allantoin；chlordiazepoxide；HPCE

*通信作者：畢曉黎（1979—），女，博士，主任中藥師，碩士生導師，從事中藥質量評價研究。Tel：（020）83482098，E-mail：2335128654@qq.com

作者簡介：陳 昭（1985—），男，博士，主管藥師，從事藥物活性成分的分析測定研究。Tel：（020）83482098，E-mail：cz20081331 @126.com

基金項目：廣東省中醫藥局科研課題（20141027）

收稿日期：2015-05-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.023

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1074-04