SPE-HPLC法測定三尖杉中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿

吳方評， 金　蘋， 姚祖福， 楊　勇， 劉良紅

（湖南醫藥學院，侗醫藥研究湖南省重點實驗室，湖南懷化418000）

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SPE-HPLC法測定三尖杉中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿

吳方評， 金蘋， 姚祖福， 楊勇， 劉良紅

（湖南醫藥學院，侗醫藥研究湖南省重點實驗室，湖南懷化418000）

摘要：目的 采用固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）法測定三尖杉CePhalotaxus fortunei Hook.f.中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿。方法 三尖杉90％乙醇提取液的分析采用迪馬Diamonil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶水（含0.1 g十二烷基磺酸鈉和0.1％磷酸，42∶58），等度洗脫；體積流量為0.5 mL/min；檢測波長為291 nm。結果 三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿在2.48～49.60、2.51～50.20 μg/mL范圍內線性關系良好，平均回收率（n =5）分別為95.4％、95.1％，RSD分別為1.83％、1.91％。兩種成分的含有量在莖中最高，而在葉中最低。結論該方法可用于測定該植物中的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿，效果理想。

關鍵詞：三尖杉；三尖杉酯堿；高三尖杉酯堿；SPE-HPLC

三尖杉屬隸屬于三尖杉科裸子植物，該科僅三尖杉1屬9種，產于亞洲東部至南亞次大陸，在我國分布最為集中［1］。三尖杉酯堿（HT）和高三尖杉酯堿（HHT）是從三尖杉CePhalotaxus fortunei Hook.f.中分離出的具有抗腫瘤活性的生物堿，其中后者對人早幼粒白血病細胞HL-60有較強的細胞毒性［2-5］，過去30年被廣泛用于急性、慢性粒細胞性白血病的治療，取得了較好的效果［6-8］；前者對HL-60和人白血病細胞K562也具有凋亡作用［9-10］。目前，這兩種成分主要從三尖杉屬植物中分得，而海南粗榧內生真菌細極鏈格孢CH1307發酵后也可得到高三尖杉酯堿［11］。生物樣品中，高三尖杉酯堿的含有量主要通過HPLC法進行測定［12-13］，而三尖杉酯堿與其結構非常相似，但尚無同時測定這兩種成分的文獻報道。本實驗通過固相萃取方法對三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿進行富集，然后采用HPLC法同時測定其含有量。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 研究對象 三尖杉樣品采自湖南省洪江市雪峰山自然保護區，經湖南醫藥學院中藥現代化研究中心汪冶教授鑒定為三尖杉屬植物。

1.1.2 主要儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器及漢化版化學工作站；迪馬Diamonil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；島津AUW120D電子分析天平；LC-350A超聲波中藥處理機；Waters Sep -Pak -C18固相萃取小柱。

1.2 主要試劑 高三尖杉酯堿對照品（批號

111533-200403，中國食品藥品檢定研究院）；三尖杉酯堿對照品（批號26833-85-2，南京春秋生物工程有限公司，含有量98％以上）。乙腈為色譜純（天津賽福瑞科技有限公司）；乙醇為分析純（重慶川東化工集團有限公司化學試劑廠）；其他試劑均為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取三尖杉酯堿4.96 mg、高三尖杉酯堿5.02 mg，置于10 mL量瓶中，流動相溶解并定容至刻度，即得0.496 mg/mL三尖杉酯堿和0.502 mg/mL高三尖杉酯堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取三尖杉適量，粉碎，過100目篩，精密稱取0.10 g，置于50 mL量瓶中，加入90％乙醇40 mL，浸潤10 min，超聲提取45 min，水浴加熱揮去乙醇至微干，5 mL乙醇溶解，蒸餾水定容至刻度，超聲處理10 min，以5 mL/min的體積流量通過預處理的Sep-Park-C18固相萃取小柱，5 mL二次蒸餾水過柱洗滌，5 mL 20％乙醇淋洗，離心，3 mL 90％乙醇洗脫，棄去最初的3滴，流動相定容至10 mL，即得。

2.1.3 色譜條件 迪馬Diamonil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶水（含0.1 g十二烷基磺酸鈉和0.1％磷酸，42∶58）；檢測波長291 nm；體積流量0.5 mL/min；進樣量10 μL。進樣前，對照品和樣品溶液用0.45 μm針頭過濾器過濾。

2.2 結果

2.2.1 系統適應性試驗 在“2.1.3”項色譜條件下，三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對照品溶液及三尖杉供試品溶液分別進樣10 μL測定，記錄色譜圖，見圖1。由圖可知，兩種成分的保留時間分別為13.255 min和15.185 min，理論塔板數大于6 000，分離度大于1.5，基線基本分離，峰形對稱，表明該條件可用于分析測定。

2.2.2 線性關系的考察 分別精密量取三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對照品貯備液適量，置于5個10 mL量瓶中，流動相定容至刻度，分別配制成2.48、4.96、9.92、24.8、49.60 μg/mL三尖杉酯堿和2.51、5.02、10.04、25.10、50.20 μg/mL高三尖杉酯堿校正液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣。以質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），面積響應值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程分別為三尖杉酯堿Y=8.103 3X-5.850 2（r= 0.999 4）、高三尖杉酯堿Y=4.735 5X+1.312 1，（r=0.999 8），表明兩種成分分別在2.48～49.60、2.51～50.20 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.三尖杉酯堿 2.高三尖杉酯堿1.harringtonine 2.homoharringtonine圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.2.3 檢測限和定量限的考察 將三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對照品溶液逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時的進樣量為最低檢測限（LOD），為10時的進樣量為最低定量限（LOQ）。結果，兩種成分的檢測限分別為0.001 2、0.001 2 μg，定量限分別為0.012 0、0.012 0 μg。

2.2.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下分別于0、1、2、4、8、16、24 h進樣10 μL，測得兩種成分峰面積RSD分別為3.01％和2.55％，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 精密度試驗 取“2.1.1”項下三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對照品溶液，進樣5次，測得兩種成分峰面積RSD分別為2.87％和2.65％，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一批次三尖杉樣品0.1 g，共5份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下分析，測得兩種成分平均含有量分別為0.849 5 mg/g和1.889 7 mg/g，RSD（n =5）分別為2.95％和2.43％，表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收試驗 精密稱取同批次含有量已知（三尖杉酯堿0.849 5 mg/g、高三尖杉酯堿1.889 7 mg/g）的三尖杉0.1 g，共6份，置于6只50 mL量瓶中，分為3組，每組分別加入三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿貯備液0.5、0.25、0.125 mL，每個質量濃度制備5份，按“2.1.2”項下方法處理，在“2.1.3”項色譜條件下分析，結果見表1和表2。

表1　三尖杉酯堿加樣回收試驗結果（n=5）Tab.1 Results of recovory tests for harringtonine（n=5）

表2　高三尖杉酯堿加樣回收試驗結果（n=5）Tab.2 Results of recovory tests for homoharringtonine （n=5）

2.2.8 含有量測定 精密稱取不同部位（根、莖和葉）的三尖杉樣品，每個部位5份，按“2.1.2”項下方法處理、在“2.1.3”項色譜條件下分析，外標法進行含有量測定，結果見表3。

表3　含有量測定結果（n=5）Tab.3 Determ ination results of contents（n=5）

3 討論

3.1 流動相及體積流量的選擇 實驗發現，流動相為乙腈∶水（含0.1 g十二烷基磺酸鈉和0.1％磷酸，42∶58）、體積流量為0.5 mL/min時峰形對稱，出峰時間適宜，三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿分離度較大，雜質峰對被檢測峰干擾小。

3.2 檢測波長的選擇 紫外掃描發現，三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿在291 nm處均有最大吸收。因此，選擇檢測波長為291 nm。

3.3 提取方法和提取溶劑的優選 本實驗考察了無水乙醇、90％乙醇、50％乙醇、100％甲醇和50％甲醇，發現以90％乙醇為提取溶劑，超聲提取45 min后，待測物能提取完全。

3.4 固相萃取條件的優選

3.4.1 吸附材料 由于三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的極性較小，故吸附富集材料選用C18反相鍵合硅膠（30 mg），使用前甲醇活化。該材料在水相中對兩種成分的保留較好，而在有機相（如乙醇）中保留較差，故本實驗用90％乙醇超聲提取后濃縮至微干，少量乙醇溶解后再用水定容，以保證其能在吸附材料上充分保留。

3.4.2 淋洗溶劑 考察了10％、20％、30％、50％、70％和90％乙醇對富集物的淋洗效果，發現10％和20％乙醇不能洗脫三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿，而70％和90％乙醇可以。因此，先用5 mL二次蒸餾水淋洗萃取小柱，再用5 mL 10％乙醇淋洗以除去雜質，離心，3 mL 90％乙醇可把兩種成分完全洗脫，再用流動相定容。

3.4.3 過柱及洗脫體積流量 體積流量在5 mL/min時，既能保證三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的富集，又顯示了較高的效率。另外，3 mL 90％乙醇在3 mL/min條件下即能把兩種成分完全洗脫。因此，本實驗選擇5 mL/min作為樣品富集過柱體積流量，3 mL/min作為樣品洗脫體積流量。

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Determ ination of harringtonine and homoharringtonine in CePhalotaχus fortunei by SPE-HPLC

WU Fang-ping， JIN Ping， YAO Zu-fu， YANG Yong， LIU Liang-hong
（Hunan University of Medicine，Hunan p rovincial Key Laboratory of Dong pharmaceutical Research，Huaihua 418000，China）

ABSTRACT：AIM To determine harringtonine and homoharringtonine in CePhalotaxus fortunei Hook.F.by solid phase extraction-high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.METHODS The analysis of 90％ ethanol extract of C.fortunei was performed on Diamonil C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobile phase was acetonitrile-water（containing 0.1 g sodium dodecylsulphate and 0.1％phosphate，42∶58）with isocratic elution，flow ratewas0.5 mL/min and detection wavelength was setat291 nm.RESULTS Harringtonine and homoharringtonine showed good linear relationships within the ranges of 2.48 -49.60 μg/mL and 2.51 -50.20 μg/mL，whose average recoveries（n =5）were 95.4％and 95.1％with the RSDs of1.83％and 1.91％，book=1071,ebook=117respectively.The contents of these two constituents were the highest in stems and the lowest in leaves.CONCLUSION Thismethod can be used for the determination of harringtonine and homoharringtonine in this plantwith great effect.

KEY WORDS：CePhalotaxus fortunei Hook.F.；harringtonine；homoharringtonine；SPE-HPLC

作者簡介：吳方評（1972—），男（侗族），碩士，副教授，從事藥物制劑質量控制研究。Tel：15576513046，E-mail：wfp1013 @ 163.com

基金項目：湖南省懷化市科技局科研項目（2014-19）

收稿日期：2015-07-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.022

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1070-04