LC-MS法檢驗(yàn)減肥類產(chǎn)品中非法添加的氟西汀

馬春艷， 封淑華， 馮　麗， 段　瓊， 胡偉杰

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011）

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LC-MS法檢驗(yàn)減肥類產(chǎn)品中非法添加的氟西汀

馬春艷， 封淑華*， 馮麗， 段瓊， 胡偉杰

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011）

摘要：目的 建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法測(cè)定減肥類產(chǎn)品中非法添加的氟西汀。方法 質(zhì)譜定性分析采用Shimadzu Shim-pack XR-ODS色譜柱（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L乙酸銨（含0.1％乙酸），梯度洗脫；體積流量0.3 mL/min。液相色譜定量分析采用Inertsil ODS-SP C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.8％三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH至5.8）（5∶35∶60）；檢測(cè)波長226 nm；體積流量1.0 mL/min。結(jié)果 在72批樣品中，有2批（均為平衡素）非法添加了氟西汀。結(jié)論 該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于檢驗(yàn)非法添加的氟西汀。

關(guān)鍵詞：減肥類產(chǎn)品；非法添加；氟西汀；LC-MS

Detection of fluoxetine illegally added into slimm ing products by LC-MS

MA Chun-yan， FENG Shu-hua*， FENG Li， DUAN Qiong， HUWei-jie
（Hebei p rovincial Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China）

ABSTRACT：AIM To establish a liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS）method for the determination of fluoxetine illegally added into slimming products.METHODS The qualitative analysis bymass spectrometry was performed on a Shimadzu Shim-pack XR-ODS column（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）with mobile phase comprising ofmethanol-0.01 mol/L ammonium acetate（containing 0.1％acetic acid）in a gradient elution manner，and flow rate of0.3 mL/min.The quantitative analysis by liquid chromatography was conducted on an Inertsil ODS-SPC18column（150 mm×4.6 mm，5 μm）with mobile phase containingmethanol-acetonitril-0.8％ triethylamine（pH value adjusted to 5.8 by phosphoric acid）（5∶35∶60）at a flow rate of 1.0 mL/min，and detection wavelength of 226 nm.RESULTS In 72 batches of samples，two batches of Pinghengsu Capsuleswere found illegally added into fluoxetine.CONCLUSION This accurate and highly sensitivemethod can be used for the rapid detection of illegally added fluoxetine.

KEY WORDS：slimming products；illegally added；fluoxetine；LC-MS

近年來，一些不法分子為了牟取經(jīng)濟(jì)利益，在中成藥和保健食品中非法添加各類化學(xué)藥物［1-3］，減肥類中成藥、保健食品中非法添加的情況尤為嚴(yán)重，對(duì)服用者安全造成嚴(yán)重隱患，甚至危及生命［4-5］。然而，國家減肥類藥物非法添加補(bǔ)充方法中只收載了8種藥物［6-8］，而在實(shí)際監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，違法添加的手段和種類［9-11］不斷更新變化，相關(guān)檢驗(yàn)方法滯后，造成行政監(jiān)督“無法可依”的現(xiàn)實(shí)問題。為此，我院系統(tǒng)、全面地研究中成藥、保健食品（包括食品但以保健食品形式宣傳、銷售）中非法添加減肥類藥物的檢測(cè)方法，廣泛收集臨床上副作用明顯、具有減肥效果的藥物［12-20］，建立液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）檢測(cè)方法，形成較全面的減肥藥數(shù)據(jù)庫，達(dá)到同時(shí)快速篩查和監(jiān)測(cè)的目的。按我院初步建立的減肥數(shù)據(jù)庫，已在監(jiān)督抽檢中檢測(cè)到減肥類中成藥及保健食品中添加了精神類藥物—食欲抑制劑氟西汀。

氟西汀又名百憂解（fluoxetine，商品名Prozac），是一種口服抗抑郁藥，主要是抑制中樞神經(jīng)對(duì)5-羥色胺的再吸收，用于治療抑郁癥［21］、強(qiáng)迫癥及暴食癥，但服用者在未知情況下過量服用，會(huì)危害身體健康。因此，迫切需要建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定性定量方法。

本實(shí)驗(yàn)以氟西汀為研究對(duì)象，采用質(zhì)譜（MS）精確定性和液相色譜（LC）準(zhǔn)確定量相結(jié)合的方法，建立了減肥類中成藥及保健食品中非法添加氟西汀的檢驗(yàn)方法，可擴(kuò)大國家食品藥品監(jiān)督管理總局補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的檢測(cè)范圍。

1 儀器與試藥

戴安U3000高效液相色譜儀；AB TripleTOF? 5600+液質(zhì)聯(lián)用儀；Milli-Q超純水器；KH-800 KDE超聲波清洗器。甲醇為色譜純（德國Merck公司）；乙酸為色譜純（美國Fisher公司）；乙酸銨為色譜純（美國Sigma公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（自制）。鹽酸氟西汀（規(guī)格50 mg，含有量100.0％）購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100513-200401。樣品均為市售中成藥或保健食品。

2 檢測(cè)條件

2.1 LC-MS色譜條件 Shimadzu Shim-pack XRODS色譜柱（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）；流動(dòng)相為0.01 mol/L乙酸銨溶液（A）-甲醇（B）（含0.1％乙酸），梯度洗脫（0～1 min，20％B；1～6 min，20％～80％B；6～8 min，80％B）；柱溫30℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。

2.2 MS條件 Turbo VTM離子源；電噴霧電離（ESI）探針，正離子掃描；信息觸發(fā)采集模式（IDA）；GS1、GS2（379 kPa）；CUR Gas（207 kPa）；離子源溫度550℃；電噴霧電壓5 500 V；去簇電壓80 V；碰撞能量24 V；TOF-MS一級(jí)質(zhì)譜全掃描范圍m/z100～1 000；TOF-MS/MS二級(jí)質(zhì)譜全掃描范圍m/z40～1 000。

2.3 LC條件 Inertsil ODS-SP C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-乙腈-0.8％三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH至5.8）（5∶35∶60）；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長226 nm。

3 方法與結(jié)果

3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸氟西汀對(duì)照品適量，甲醇振搖溶解，制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度為0.2mg/mL）。

3.2 供試品溶液的制備 若供試品為液體，精密量取本品1次服用量；若供試品為固體制劑，取本品研細(xì)后，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于1次服用量），置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲15 min，放冷至室溫，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。視樣品質(zhì)量濃度情況，對(duì)其進(jìn)行一定程度的稀釋。

3.3 空白溶液的制備 稱取茶類和膠囊類空白樣品，按“3.2”項(xiàng)下方法處理，即得。

3.4 氟西汀的MS分析 氟西汀對(duì)照品的準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為310，產(chǎn)生的二級(jí)碎片主要為m/z44、148，質(zhì)譜圖見圖1，發(fā)現(xiàn)與美國Lilly研究實(shí)驗(yàn)室文獻(xiàn)［22］中的標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜圖一致，裂解途徑見圖2。

圖1　氟西汀質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of fluoxetine

圖2　氟西汀裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathway of fluoxetine

3.5 樣品色譜分析 供試品與對(duì)照品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者的色譜峰保留時(shí)間、紫外吸收光譜圖一致，見圖3和圖4。

1.氟西汀 1.fluoxetine圖3　HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

圖4　紫外吸收光譜圖Fig.4 UV absorption spectra

3.6 專屬性 分別取對(duì)照品、供試品和空白樣品溶液5 μL，注入液相色譜儀，發(fā)現(xiàn)氟西汀與其他雜質(zhì)峰分離度良好，空白樣品無干擾。見圖5。

1.氟西汀 1.fluoxetine圖5　專屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of specificity tests

3.7 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別稀釋成0.004、0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8 mg/mL對(duì)照品溶液，注入HPLC色譜儀，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y= 130.41X-0.031 4（r=0.999 9），表明氟西汀在0.004～0.800 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取鹽酸氟西汀對(duì)照品溶液（0.200 mg/mL）5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其峰面積RSD為0.4％，表明儀器精密度良好。

3.9 檢出限及定量限 精密稱取空白樣品適量，加入不同體積對(duì)照品溶液，按“3.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定。結(jié)果，按信噪比S/N為3，檢出限為0.27 mg/g；按信噪比S/N為10，定量限為1.33 mg/g。

3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品和樣品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、24 h分析，測(cè)得峰面積RSD分別為0.4％和0.3％，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.11 回收率 分別取減肥茶類和膠囊劑類陰性樣品各9份，精密加入3個(gè)質(zhì)量濃度的鹽酸氟西汀對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定。結(jié)果，減肥茶類樣品平均回收率為96.9％，RSD為0.9％；膠囊劑類樣品平均回收率為101.0％，RSD為1.9％，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

3.12 耐用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品、供試品、空白溶液適量，分別在3根色譜柱上進(jìn)行測(cè)定，型號(hào)和規(guī)格見表1。結(jié)果，3根色譜柱上氟西汀與其他峰分離度均良好，保留時(shí)間適中，空白樣品在氟西汀位置處無干擾。

表1　色譜柱型號(hào)和規(guī)格Tab.1 Types and sizes of columns

4 樣品測(cè)定

4.1 樣品的MS定性篩查 在“2.2”項(xiàng)條件下，采用TOF-MS信息相關(guān)采集模式，取對(duì)照品溶液（1 μg/mL）和樣品溶液5 μL，注入LC-MS聯(lián)用儀，MS定性初步篩選出72批監(jiān)督抽檢的樣品（其中減肥膠囊劑41批，茶劑25批，片劑4批，丸劑1批，顆粒劑1批）。通過比較各樣品與對(duì)照品的液相色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜的全掃描一級(jí)圖和二級(jí)圖，發(fā)現(xiàn)有2批樣品與對(duì)照品溶液一致，故確定其呈陽性，即非法添加了氟西汀。檢出結(jié)果見表2，質(zhì)譜圖見圖6。

表2　氟西汀檢出結(jié)果Tab.2 Resu lts of fluoxetine detection

圖6　樣品質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectra of samp les

4.2 樣品的LC測(cè)定 對(duì)MS定性初篩呈陽性的2批樣品進(jìn)行定量測(cè)定，在“2.3”項(xiàng)條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其含有量。結(jié)果，2批樣品中氟西汀的含有量分別為66.7 mg/g（平衡素，無批號(hào)）和63.3 mg/g（平衡素，批號(hào)SAZ0606A），相當(dāng)于每粒含氟西汀20.0 mg和19.0 mg，與西藥服用量相當(dāng)。

5 討論

當(dāng)保健食品中違禁添加化學(xué)成分時(shí)，為達(dá)到一定的治療效果，添加量通常為藥用劑量，故在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)離子流圖中出現(xiàn)明顯的色譜峰，并且不在國家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法收載的非法添加化學(xué)物質(zhì)中時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行仔細(xì)研究，確定是否為新型添加化學(xué)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中檢出的非法添加化學(xué)藥品氟西汀為國家食品藥品監(jiān)督管理總局“打非”過程中采用本院建立的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫篩查時(shí)所發(fā)現(xiàn)，表明在減肥類中成藥及保健食品中添加該成分是一種新動(dòng)向，需引起相關(guān)機(jī)構(gòu)的高度重視。

本實(shí)驗(yàn)基于LC-MS聯(lián)用技術(shù)所提供的高靈敏度、高選擇性、高精確質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可迅速完成對(duì)樣品的高精度一級(jí)、二級(jí)掃描，并得到精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息，從而對(duì)未知非法添加藥物進(jìn)行快速、全面的分析。同時(shí)，與對(duì)照品和文獻(xiàn)［9］進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)高分辨質(zhì)譜在打擊非法添加藥物的工作中將發(fā)揮更為重要的作用。

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［成分分析］

*通信作者：封淑華（1864—），女，主任藥師，從事藥物分析研究。Tel：（0311）89892090，E-mail：shuhua08@sina.com

作者簡(jiǎn)介：馬春艷（1984—），女，碩士，工程師，從事保健食品和藥物分析研究。Tel：（0311）85212004-8082，E-mail：nancyma054 @163.com

基金項(xiàng)目：河北省食品藥品監(jiān)督管理局重點(diǎn)科技項(xiàng)目（ZD2014006）

收稿日期：2015-12-29

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.019

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1056-06