參芪養(yǎng)心丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

來(lái)澤渲， 胡　北， 馬宏達(dá)， 史國(guó)兵*

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧錦州121000；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110016）

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參芪養(yǎng)心丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

來(lái)澤渲1， 胡北2， 馬宏達(dá)2， 史國(guó)兵2*

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧錦州121000；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110016）

摘要：目的 建立參芪養(yǎng)心丸（黃芪、丹參、苦參等）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 TLC法定性鑒別黃芪、丹參和苦參，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法測(cè)定黃芪甲苷的含有量，高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）法同時(shí)測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿的含有量。結(jié)果 黃芪、丹參、苦參的分離度良好，斑點(diǎn)清晰。黃芪甲苷在0.995 0～31.84 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 5），平均回收率為99.4％，RSD為1.5％（n =6）。苦參堿和氧化苦參堿的線(xiàn)性范圍分別為0.001 250～0.036 00 mg/mL（r=0.999 7）和0.000 898 4～0.028 75 mg/mL（r=0.999 6），平均回收率分別為98.2％（RSD=1.6％）和98.4％（RSD=1.7％）。結(jié)論 該標(biāo)準(zhǔn)能有效控制參芪養(yǎng)心丸的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：參芪養(yǎng)心丸；黃芪；丹參；苦參；黃芪甲苷；苦參堿；氧化苦參堿

Quality standard for Shenqiyangxin Pills

LAIZe-xuan1， HU Bei2， MA Hong-da2， SHIGuo-bing2 *
（1.postgraduate Training Base，General HosPital of Shenyang Military Region，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.General HosPital of Shenyang Military Region，Shenyang 110016，China）

ABSTRACT：AIM To establish the quality standard for Shenqiyangxin Pills（Astragalusmembranaceus，Salvia miltiorrhiza，SoPhora flavescens，etc.）.METHODS TLC was used for the qualitative analyses of Astragalus membranaceus，Salvia miltiorrhiza and SoPhora flavescens，while high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector（HPLC-ELSD）was applied to the quantitative analysis of astragaloside，and high performance liquid chromatography-ultroviolet（HPLC-UV）was used for that ofmatrine and oxymatrine.RESULTS Clear spots from TLC verified the good separations of Astragalusmembranaceus，Salvia miltiorrhiza and SoPhora flavescens，Astragaloside showed a good linear relationship within the range of0.995 0 -31.84 μg（r=0.999 5），whose average recovery was 99.4％with the RSD of 1.5％（n =6）.The linear ranges ofmatrine and oxymatrine were 0.001 250 -0.036 00 mg/mL（r=0.999 7）and 0.999 7 -0.028 75 mg/mL（r=0.999 6），whose average recoverieswere 98.2％（RSD=1.6％）and 98.4％（RSD=1.7％），respectively.CONCLUSION This standard can help to control the quality of Shenqiyangxin Pills effectively.

KEY WORDS：Shenqiyangxin Pills；Astragalusmembranaceus；Salvia miltiorrhiza；SoPhora flavescens；astragaloside；matrine；oxymatrine

參芪養(yǎng)心丸是我院院內(nèi)制劑，現(xiàn)已上市銷(xiāo)售，批準(zhǔn)文號(hào)沈制字（2011）F01039。該制劑由黃芪、苦參、丹參、黨參、玄參、沙參、炙甘草7味藥材組成，具有滋陰養(yǎng)血，益氣養(yǎng)心的功效，臨床上用于治療心律不齊、室性早搏。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前只有苦參中的苦參總堿［1］、丹參中的丹參酮ⅡA［2］、黃芪中的黃芪甲苷具有治療心律不齊的作用［3］，故本實(shí)驗(yàn)選擇上述3種成分作為該制劑的主要藥效成分，用于進(jìn)行質(zhì)量控制。通過(guò)TLC法對(duì)黃芪、丹參、苦參進(jìn)行定性控制，通過(guò)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行定量控制，通過(guò)高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）法同時(shí)測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿的含有量。同時(shí)，還對(duì)黃芪甲苷含有量測(cè)定的前處理方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀，包括Model 1000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、2487紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）。

1.2 材料 黃芪甲苷（批號(hào)110781-201314）、丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200619）、苦參堿（批號(hào)110805-200508）、氧化苦參堿（批號(hào)110780-201007）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。黃芪（批號(hào)120974-200609）、丹參（批號(hào)120923-200912）、苦參（批號(hào)121019-200304）對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。參芪養(yǎng)心丸（沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，批號(hào)20130710、20140923、20150121）。黃芪、丹參、苦參陰性樣品（自制）。

1.3 試劑 乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；其他試劑均為分析純；水為液相水。

2 TLC鑒別

2.1 參芪養(yǎng)心丸中黃芪的鑒別

2.1.1 樣品溶液的制備 取3批樣品各20 g，粉碎，加50 mL正丁醇，超聲1 h（40 kHz、150 W），過(guò)濾，濾液用1％氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次35 mL，棄去下層，水飽和正丁醇將上層液洗到中性，分層，棄去下層，剩余液體水浴蒸干，1 mL甲醇溶解殘?jiān)吹谩?/p>

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取對(duì)照藥材0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 取黃芪陰性樣品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.4 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.1.5 薄層條件 吸取上述溶液各5 μL，用毛細(xì)管點(diǎn)于同一硅膠G板上，預(yù)飽和40 min，展開(kāi)劑為二氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液，顯色劑為10％硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至清晰顯色。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 參芪養(yǎng)心丸中丹參的鑒別

2.2.1 樣品溶液的制備 取3批已粉碎的樣品各30 g，加80 mL乙醚15 g和硅藻土，超聲40 min （40 kHz、150 W），過(guò)濾，濾液水浴蒸干，1 mL乙酸乙酯溶解殘?jiān)吹谩?/p>

2.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取丹參對(duì)照藥材2 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取丹參陰性樣品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.4 對(duì)照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制成1 mg/mL對(duì)照品溶液。

1.黃芪 2.黃芪甲苷 3.黃芪陰性樣品 4～6.樣品1.Astragalusmembranaceus 2.astragaloside 3.negative sample without Astragalusmembranaceus 4 -6.samples圖1　黃芪TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Astragalusmembranaceus

2.2.5 薄層條件 吸取上述溶液各3 μL，用毛細(xì)管點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯（4∶1），晾干顯色。結(jié)果見(jiàn)圖2。

1～3.樣品 4.丹參 5.丹參酮ⅡA6.丹參陰性樣品1 -3.samples 4.Salvia miltiorrhiza 5.tanshinoneⅡA6.negative sample without Salvia miltiorrhiza圖2　丹參TLC色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Salvia M iltiorrhiza

2.3 參芪養(yǎng)心丸中苦參的鑒別

2.3.1 樣品溶液的制備 取3批已粉碎的樣品各10 g，加5 mL氨水和100 mL二氯甲烷，超聲40 min（40 kHz 150 W），過(guò)濾，濾液水浴蒸干，1 mL二氯甲烷溶解殘?jiān)吹谩?/p>

2.3.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取苦參對(duì)照藥材0.5 g，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 取苦參陰性樣品適量，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 取苦參堿對(duì)照品1 mg，加二氯甲烷制成1 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.3.5 薄層條件 吸取上述溶液各3 μL，用毛細(xì)管點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開(kāi)劑為二氯甲烷-氨水-甲醇（5∶0.3∶0.2）的下層液，顯色劑為碘化鉍鉀溶液。結(jié)果見(jiàn)圖3。

1～3.樣品 4.苦參 5.苦參堿 6.苦參陰性樣品1 -3.samples 4.SoPhora flavescens 5.matrine 6.negative sample without SoPhora flavescens圖3　苦參TLC色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of SoPhora flavescens

3 黃芪甲苷含有量測(cè)定

3.1 色譜條件［4］Welchrom-C18色譜柱（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫室溫；流動(dòng)相乙腈-水（32∶68）；體積流量1.0 mL/min；漂移管溫度70℃。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL含0.398 0 mg的黃芪甲苷溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取已粉碎的樣品5 g，50 mL純甲醇中浸泡過(guò)夜，索氏提取4 h，提取液水浴蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，水飽和正丁醇萃取4次，每次40 mL，收集正丁醇層，再用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，蒸干正丁醇液，殘?jiān)? mL水溶解，過(guò)D-101大孔吸附樹(shù)脂柱，依次用蒸餾水80 mL、40％乙醇100 mL、70％乙醇200 mL洗脫，收集70％乙醇洗脫液，水浴蒸干，甲醇溶解殘?jiān)? mL量瓶定容，即得。

3.2.3 陰性樣品溶液的制備 取黃芪陰性樣品，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

3.3 專(zhuān)屬性考察 吸取上述溶液各20 μL，注入HPLC-ELSD色譜儀中分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，黃芪甲苷的保留時(shí)間約為15.1 min，而且陰性樣品不干擾測(cè)定，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

1.黃芪甲苷1.astragaloside圖4　HPLC-ELSD色譜圖Fig.4 HPLC-ELSD chromatogram s

3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 吸取0.049 75、0.099 50、0.199 0、0.398 0、0.796 0、1.592 0 mg/mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液各20 μL，注入HPLC-ELSD色譜儀中分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/mL）的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪制曲線(xiàn)，得回歸方程Y=1.487 1X+9.137 8，r=0.999 5（n =6），表明黃芪甲苷在0.995 0～31.84 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.5 精密度考察 吸取含0.398 0 mg/mL黃芪甲苷的對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得RSD 為2.1％，表明儀器精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（批號(hào)20130710）5份，每份20 μL，在0、2、4、8、 12 h進(jìn)樣，測(cè)得RSD為2.8％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性考察 精密稱(chēng)取同一樣品（批號(hào)20130710）6份，每份5 g，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測(cè)得黃芪甲苷的平均含有量為0.347 7 mg/g，RSD為2.4％（n =6），表明該方法重復(fù)性較好。

3.8 回收率考察 精密稱(chēng)取樣品（批號(hào)20130710，含黃芪甲苷0.347 7 mg/g）2.5 g，共6份，加入對(duì)照品溶液（0.349 1 mg/mL）2.5 mL，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　黃芪甲苷回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for astragaloside

3.9 樣品含有量測(cè)定 取3批樣品，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，吸取對(duì)照品10、20 μL，以及供試品20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，暫定參芪養(yǎng)心丸中黃芪甲苷的含有量不得少于0.1 mg/g。

表2　含有量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determ ination

4 苦參堿和氧化苦參堿含有量的同時(shí)測(cè)定

4.1 色譜條件 Diamonsil-Cl8色譜柱（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫室溫；流動(dòng)相乙腈-甲醇-0.1％磷酸鹽溶液（三乙胺調(diào)pH 至7.5）（12∶5∶83）［5］；體積流量1.0 mL/min。

4.2 溶液的制備

4.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL溶液含1.15 mg氧化苦參堿和1.44 mg苦參堿的溶液，作為貯備液，稀釋10倍，即得。

4.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取已粉碎的樣品10 g，加4 mL氨水和100 mL二氯甲烷，超聲提取30 min，濾過(guò)，提取液水浴蒸干，殘?jiān)?0 mL甲醇溶解定容，即得。

4.2.3 陰性溶液 取苦參陰性樣品，按“4.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

4.3 專(zhuān)屬性考察 吸取上述溶液各20 μL，注入HPLC-UV色譜儀中分析。結(jié)果，兩者均能很好地與其他組分分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3 000，陰性樣品無(wú)干擾。

4.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 將混合對(duì)照品稀釋成6個(gè)質(zhì)量濃度（苦參堿分別為0.036、0.018、0.009、0.004 5、0.002 25、0.001 25 mg/mL，氧化苦參堿分別為0.028 75、0.014 38、0.007 188、0.003 594、0.001 797、0.000 898 4 mg/mL），吸取上述溶液各20 μL，注入HPLC-UV色譜儀中分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制曲線(xiàn)，得苦參堿的線(xiàn)性方程Y=69 762 657X+366 386，r=0.999 7（n = 6）；氧化苦參堿的線(xiàn)性方程Y=93 741 610X+ 160 056，r=0.999 6（n =6），表明苦參堿在0.025～0.720 μg、氧化苦參堿在0.017 97～0.575 0 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

4.5 精密度考察 吸取含0.009 mg/mL苦參堿、0.007 188 mg/mL氧化苦參堿的混合對(duì)照品溶液各20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得兩者峰面積RSD分別為0.57％、0.63％，表明儀器精密度良好。

4.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（批號(hào)20130710）5份，每份20 μL，在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣分析，測(cè)得苦參堿和氧化苦參堿峰面積RSD分別為0.72％和0.77％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.7 重復(fù)性考察 精密稱(chēng)定同一批樣品（批號(hào)20130710）6份，每份10 g，按“4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測(cè)得苦參堿和氧化苦參堿平均含有量分別為0.131 0 mg/g和0.015 36 mg/g，RSD均約為1.7％（n =6），表明該方法重復(fù)性較好。

4.8 回收率考察 精密稱(chēng)取樣品（批號(hào)20130710，含苦參堿0.131 0 mg/g，氧化苦參堿0.015 36 mg/g）5 g，共6份，加入對(duì)照品溶液（含苦參堿0.132 2 mg/mL，氧化苦參堿0.016 40 mg/mL）5 mL，按“4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　苦參堿和氧化苦參堿回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for matrine and oxymatrine

4.9 樣品含有量測(cè)定 取3批樣品，按“4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，吸取對(duì)照品10、20 μL，供試品20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算。結(jié)果，苦參堿平均含有量為0.130 6 mg/g，RSD為1.8％；氧化苦參堿平均含有量為0.014 96 mg/g，RSD為2.0％。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，暫定參芪養(yǎng)心丸中苦參堿和氧化苦參堿的總含有量不得少于0.1 mg/g。

5 討論

在測(cè)定黃芪甲苷的含有量前，本實(shí)驗(yàn)先對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行了研究。首先比較索氏提取和超聲提取，發(fā)現(xiàn)前者更有效。然后考察50％、70％、100％甲醇，發(fā)現(xiàn)100％甲醇的提取效果最佳。再研究2、4、6 h提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)4 h和6 h時(shí)黃芪甲苷的提取量相差不大，并均明顯高于2 h。最終，確定前處理方法為100％甲醇，索氏提取4 h。

TLC法鑒別丹參時(shí)，曾采用了《中國(guó)藥典》2010年版［4］中丹參脂溶性成分的鑒別方法，但斑點(diǎn)分散，故減少了點(diǎn)樣量，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)明顯清晰。

《中國(guó)藥典》中苦參的薄層層析和顯色［4］較復(fù)雜，操作性不強(qiáng)。因此，考察了苯-丙酮-乙酸乙酯-濃氨（2∶2∶4∶0.2）展開(kāi)系統(tǒng)和碘化鉍鉀顯色方式［6］，發(fā)現(xiàn)比移值過(guò)小，而采用本實(shí)驗(yàn)中的展開(kāi)劑時(shí)，避免了使用毒性較大的苯，而且斑點(diǎn)清晰，簡(jiǎn)單易行。

黃芪為參芪養(yǎng)心丸的主藥，而黃芪甲苷又是其主要活性物質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。查閱文獻(xiàn)［7-9］可知，有多種測(cè)定黃芪甲苷含有量的方法，但由于本制劑藥材較多，而且黃芪甲苷無(wú)紫外吸收，故采用HPLC-ELSD法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法能較好地測(cè)定其含有量。

在測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿含有量時(shí)，曾采用HPLC-ELSD法［10］進(jìn)行分析，但由于拖尾嚴(yán)重而放棄。在選擇流動(dòng)相時(shí)，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-無(wú)水乙醇-3％磷酸溶液（82∶9∶9）［11］，但分離效果均不如乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至7.5）。

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*通信作者：史國(guó)兵（1966—），男，博士，主任藥師，博士生導(dǎo)師，從事臨床藥學(xué)研究。E-mail：sysgb@126.com

作者簡(jiǎn)介：來(lái)澤渲（1989—），女，碩士生，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：13386838780，E-mail：lzxalk@163.com

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)課題（13ZJZ02）

收稿日期：2015-08-17

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.018

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1051-06