響應面法優選雷公藤超聲提取工藝

徐曉勇， 馬鳳森，*， 方劍喬， 梁　宜， 吳小娟

（1.浙江工業大學藥學院，浙江杭州310014；2.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，浙江杭州310009）

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響應面法優選雷公藤超聲提取工藝

徐曉勇1， 馬鳳森1，2*， 方劍喬2， 梁宜2， 吳小娟1

（1.浙江工業大學藥學院，浙江杭州310014；2.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，浙江杭州310009）

摘要：目的 優化雷公藤TriPterygium wifordii Hook.f.的超聲提取工藝。方法 以總三萜和去甲澤拉木醛為指標，以超聲功率、粉碎粒度、提取時間為影響因素，采用響應面法優化雷公藤的超聲提取工藝。結果 最優工藝參數為超聲功率400 W、粉碎粒度30目，提取時間40 min。總三萜和去甲澤拉木醛提取率分別為（1.282±0.025）％和（0.518±0.006）％。結論 該方法簡單有效，具有實際意義。

關鍵詞：雷公藤；總三萜；去甲澤拉木醛；超聲提取；響應面法

雷公藤（TriPterygium wilfordii Hook.f.）為衛矛科藤本植物，具有祛風活絡，破淤止痛等功效。現代研究表明，其有抗免疫、抗炎、抗生育及抗腫瘤等作用［1］，臨床常用于類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的治療［2-3］。

由于雷公藤毒性大，成分復雜，故藥材提取以單一成分為指標時，難以保證其質量。雷公藤全根中主要含生物堿、二萜、三萜、倍半萜及多糖［4］等成分，毒性大小依次為二萜、生物堿、三萜［5］。其中，雷公藤三萜類成分已被證明具有明顯的藥理作用，而且雷公藤紅素、去甲澤拉木醛與二萜雷公藤甲素有著顯著的抗免疫活性［3-6］，但雷公藤紅素和雷公藤甲素存在毒副作用過大、致突變性較強的缺陷［7-8］，而去甲澤拉木醛的含有量高，毒性較小，其LD50值為1 295 mg/kg［9］。因此，本實驗在前期研究［10］的基礎上，選擇去甲澤拉木醛和總三萜作為雷公藤提取工藝的指標，進行多指標的質量控制。

首先，應用單因素試驗法考察了藥材產地、藥材部位、提取方法、提取溶劑、粉碎粒度、提取時間、料液比、提取功率、提取次數對雷公藤有效成分提取率的影響。結合文獻［11］與實驗結果，選擇對結果影響較大的提取功率、粉碎粒度、提取時間3個因素進行響應面設計試驗。然后，采用Box-Benhnken法［12］對超聲提取［13］雷公藤全根藥材的最佳工藝條件進行研究。

1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀（515-717-486，美國Waters公司）；UV-1600PC紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；JY92-Ⅱ細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；PT-1004/205電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；FW177中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

雷公藤根采自浙江省景寧縣，經浙江中醫藥大學附屬第三醫院藥劑科專家鑒定為衛矛科雷公藤屬植物雷公藤TriPterygium wilfordii Hook.f.的全根，批號為20130314。去甲澤拉木醛純品購自南通飛宇生物技術有限公司，批號FY18540803，含有量99.35％。高效液相所用試劑為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 雷公藤有效成分的提取工藝 取干燥雷公藤全根，粉碎，精密稱取藥材粉末10 g，加入10倍量乙酸乙酯，超聲提取一定時間，抽濾，棄去濾渣，測量并記錄濾液體積，即得藥材提取液。

2.2 去甲澤拉木醛的含有量測定

2.2.1 色譜條件［14］Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長245 nm；流動相乙腈-0.1％磷酸水溶液（55∶45）；柱溫室溫；體積流量1.0 mL/min。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取去甲澤拉木醛對照品適量，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含去甲澤拉木醛21.35 μg/mL的溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取雷公藤乙酸乙酯提取液適量，70℃下揮干，甲醇溶解并定容至5 mL，過濾，即得。

2.2.3 專屬性試驗 取對照品和供試品溶液適量，分別注入HPLC色譜儀中測定，結果見圖1，可知供試品溶液中去甲澤拉木醛的分離度大于1.5。

1.去甲澤拉木醛1.demethylzeylasteral圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.4 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.2.1”項色譜條件下連續進樣6次，測得峰面積RSD為0.18％，表明儀器精密度良好。

2.2.5 回收率試驗 精密吸取6份等量雷公藤提取液（約含去甲澤拉木醛17 mg），稀釋后加入等量的對照品溶液，混合均勻，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，測得回收率為95.8％，RSD 為1.63％。

2.2.6 重復性試驗 取同一份雷公藤提取液適量，按“2.2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，測得RSD為1.55％，表明該方法重復性良好。

2.2.7 標準曲線的制備 取不同體積的對照品溶液注入HPLC色譜儀，在“2.2.1”項色譜條件下測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得回歸方程Y=1 200.9X-0.089 4，r=0.999 7，在0.1～1.3 μg范圍內線性關系良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h注入液相色譜儀，測得RSD為1.20％，表明溶液在10 h內穩定性良好。

2.3 總三萜的含有量測定 參考文獻［10］中的紫外分光光度法，其原理是利用三萜在無水條件下與強酸反應，形成陽碳離子鹽的顯色反應。取雷公藤提取液適量，70℃下揮干，加入5％香蘭素-冰醋酸溶液0.5 mL、高氯酸1.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱反應15 min，取出，置于冰水浴中冷卻5 min，冰醋酸定容至5 mL，搖勻。以空白對照溶液為參比，測定其在530 nm波長處的吸光度。

2.4 響應面優化雷公藤提取工藝研究 在單因素試驗的基礎上，選擇超聲功率（A）、粉碎粒度（B）、提取時間（C）作為考察因素進行響應面設計，因素水平見表1，結果見表2。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　響應面試驗結果Tab.2 Results of response surface experiments

3 響應面結果分析

3.1 模型與數據分析 由于去甲澤拉木醛為雷公藤三萜中的木栓烷型成分，故與總三萜的提取行為具有一定的相似性。Pearson相關系數分析發現，兩者提取率（Y）的相關系數r為0.923，具有顯著性關系。

應用Design-Expert8.0.5軟件進行二次多元回歸擬合，得到去甲澤拉木醛的回歸方程為Y= 5.22 +0.14A +1.25B +0.16C +0.025AB -0.098AC+0.13BC+0.19 A2-2.12B2-0.11C2，總三萜的回歸方程為Y=9.79 -0.14A+2.65 B+ 0.79 C+0.30AB+0.35AC+0.57BC+0.70 A2-3.48 B2+0.33C2。方差分析和顯著性檢驗結果見表3和表4。

表3　去甲澤拉木醛方差分析Tab.3 Analysis of variance for demethylzeylasteral

表4　總三萜方差分析Tab.4 Analysis of variance for total triterpenoids

由表可知，整體模型的的p值均小于0.05，表明其效果顯著；相關系數r分別為0.982 7、0.948 4，表明該模型與實際擬合較好，誤差較小，可對雷公藤中去甲澤拉木醛和總三萜的提取工藝進行分析和預測。另外，粉碎粒度對雷公藤有效成分提取的影響最顯著，其次為提取時間和超聲功率。二次項中B2的偏回歸系數達到非常顯著的水平，而交互項AB、AC、BC均不顯著。

3.2 響應面分析與優化 利用Design Expert軟件，得到去甲澤拉木醛和總三萜的響應曲面，見圖2和圖3，發現兩者在提取行為上一致。由圖可知，合適的藥材粉碎粒度對提取率有著非常顯著的影響，在0.5 mm左右時提取率最高，但粒度過大時將明顯下降。另外，超聲功率和提取時間對兩者的提取也有一定影響，高水平的2個因素能獲得更高的提取率。

3.3 最佳制備工藝驗證 由于去甲澤拉木醛和總三萜均具有藥理活性，并且提取行為一致，故在進行工藝優化時，設定兩者同等的權重。采用Design-Expert軟件，結合實際操作情況，得到最佳提取工藝為超聲功率400 W，粉碎粒度30目，提取時間40 min。然后，進行3次平行驗證實驗，測得去甲澤拉木醛和總三萜的提取率分別為（0.518± 0.006）％和（1.282±0.025）％，與兩者的預測值（0.567％和1.231％）較為接近。由此表明，該方程與實際情況擬合度良好，適用于回歸分析和參數優化。

圖2　去甲澤拉木醛提取率的響應面曲線圖Fig.2 Response surface curves for the extraction rate of demethylzeylasteral

圖3　雷公藤總三萜提取率的響應面曲線圖Fig.3 Response surface curves for the extraction rate of total triterpenes

4 討論

由于中藥制劑成分復雜，其療效往往是多成分、多靶點、多效應綜合作用的結果。因此，本實驗選擇去甲澤拉木醛與總三萜作為雷公藤有效成分的提取指標。目前，去甲澤拉木醛的提取方法主要為冷浸法［11］，而超聲提取在節省提取溶劑、時間，提高提取率的方面更具有優勢。

在單因素試驗中，考察了乙酸乙酯、丙酮、不同體積分數和pH的乙醇溶液，發現提取率依次為乙酸乙酯>丙酮>95％乙醇>80％乙醇> 60％乙醇。推測其原因，可能是去甲澤拉木醛和總三萜的脂溶性較強，易溶于乙酸乙酯，但由于其滲透力不強，故導致粒徑是提取率的重要影響因素。

由響應面曲線圖可知，粉碎粒度對提取率影響顯著，結合實驗操作情況，選擇過30目藥材顆粒作為工藝條件，取得了良好的效果。超聲提取藥材中的有效成分主要依賴其空化效應及各種次效應，有學者提出超聲提取藥物成分的縮核模型［15］。即顆粒內部的“核”在超聲作用下不斷溶解縮小，并向外擴散。如果粉碎粒度過大，則藥材總提取率主要由核界面層細胞的破壞速率決定，故減小藥材粒徑有利于其提取；當粉碎粒度過小時，浸取的控制步驟不是核-殼界面細胞的破碎，而是有效成分由界面穿過殼層的擴散，引起緊密堆積，導致局部有效濃度過大，從而降低提取率。

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［質 量］

Optim izing ultrasonic-assisted extraction of TriPterygium wilfordii by response surfacemethod

XU Xiao-yong1， MA Feng-sen1，2*， FANG Jian-qiao2， LIANG Yi2， WU Xiao-juan1
（1.College of pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.The Third HosPital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310009，China）

ABSTRACT：AIM To optimize the ultrasonic-assisted extraction of TriPterygium wifordii Hook.f..METHODS With total triterpenes and demethylzeylasteral as indices，aswell as influencing factors including ultrasonic power，grinded particle size and extraction time，the ultrasonic-assisted extraction of T.wifordii was optimized by response surfacemethod.RESULTS The optimized parameters were 400 W for ultrasonic power，30 mush for grinded particle size and 80 min for extraction time.The extraction rates of total triterpenes and demethylzeylasteral were（1.282±0.025）％and（0.518±0.006）％，respectively.CONCLUSION This simple and effective method holds its practical significance

KEY WORDS：TriPterygium wifordii Hook.f.；total triterpenoids；demethylzeylasteral；ultrasonic-assisted extraction；response surfacemethod

*通信作者：馬鳳森（1962—），男，教授，從事藥物新劑型研究。Tel：（0571）88871500，E-mail：merrigen@126.com

作者簡介：徐曉勇（1991—），男，碩士生，從事藥物制劑新技術研究。Tel：15068857772，E-mail：xuxiaoyongjq@163.com

基金項目：浙江省重大科技專項重點社會發展項目（2010C13014）；浙江省“重中之重”學科（針灸推拿學）開放基金項目（ZTK2010A13）

收稿日期：2015-08-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.013

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1030-05