麻黃-桂枝藥對中桂枝對麻黃堿誘導興奮性變化的抑制作用

鄭芳昊， 羅佳波

（1.佛山市中醫院，廣東佛山528000；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515）

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麻黃-桂枝藥對中桂枝對麻黃堿誘導興奮性變化的抑制作用

鄭芳昊1， 羅佳波2*

（1.佛山市中醫院，廣東佛山528000；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515）

摘要：目的 采用藥動學-藥效學（PK-PD）模型擬合法考察麻黃-桂枝藥對配伍中桂枝對麻黃堿誘導的興奮性變化的抑制作用。方法 SD大鼠分別灌胃給予生理鹽水、麻黃堿、麻黃和麻黃-桂枝藥對（3∶2）水煎液。借助微透析采樣技術，以麻黃堿在腦脊液中的質量濃度變化為PK觀察指標，以氨基酸類神經遞質谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的動態變化為PD指標。結果 最佳藥效動力學模型為Sigmoid-Emax模型。各組Glu的藥物濃度-效應（E-C）曲線均呈順時針環，各組GABA的E-C曲線均呈逆時針環。結論 麻黃堿易于產生耐受性，桂枝可以抑制麻黃堿引起的興奮性變化。

關鍵詞：麻黃；桂枝；藥對；藥動學-藥效學（PK-PD）；谷氨酸（Glu）；γ-氨基丁酸（GABA）；藥物濃度-效應（E-C）曲線；大鼠

麻黃湯是中醫治療風寒表實證的經典方劑，在臨床中應用廣泛。其中，麻黃和桂枝是發揮藥效的主要藥味，在原方中的配伍比例為3∶2。大量的實驗研究表明，麻黃-桂枝配伍可以增強藥物的發汗作用，緩解患者的發熱、鼻塞、咳喘等癥狀［1-5］。然而，由于麻黃堿對中樞神經系統和心血管系統的毒副作用，西方國家將麻黃列為有毒的天然植物添加劑［6-10］。較低劑量下，麻黃可以改變大鼠的行為學參數，出現興奮性行為變化。而在較高劑量下，長期給予麻黃將出現嚴重的不良反應，提示長期大劑量使用麻黃可能影響腦部特定區域神經細胞的正常結構和生理功能［11］。

PK-PD（pharmacokinetics-pharmacodynamics）模型（藥動學和藥效學結合模型），是在傳統藥動學和藥效學的基礎上發展而來的。通過測定特定效應的藥物濃度和藥理效應隨時間的變化，有助于了解兩者之間的內在聯系。相對于傳統的藥動學研究，PK-PD模型要求盡量了解藥物在體內作用部位的動力學特征，明確藥物在作用部位的濃度變化，以此與藥理效應更緊密的聯系在一起，定量的反應藥物濃度與效應的關系。通常PK-PD模型可以通過特定的數學模型進行擬合，通過比較參數的變化進一步掌握藥物在作用部位的綜合特性［12］。

本實驗以麻黃堿在大鼠腦脊液中的質量濃度變化為藥動學觀察指標（PK），以氨基酸類神經遞質谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的動態變化為藥效學指標（PD），闡明麻黃堿在大鼠額葉皮層的濃度-效應-時間三維關系，擬合藥物濃度及其效應經時過程的曲線，為揭示麻黃-桂枝藥對配伍的減毒機理提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材 麻黃為麻黃科植物草麻黃EPhedra sinica Stapf的干燥草質莖，產地吉林，批號110901；桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presel的干燥嫩枝，產地廣西，批號121001，均購自廣州致信中藥飲片有限公司，經南方醫科大學中藥鑒定教研室馬驥教授鑒定為正品。

1.2 試劑 鹽酸麻黃堿對照品（批號060307，赤峰艾克制藥科技有限公司）。乙腈、甲醇購自德國默克公司，均為色譜純；氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀，均為市售分析純。

1.3 儀器與耗材 微透析系統（RWD302，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；探針（CMA20，瑞典CMA/Microdialysis AB公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200 Series，美國安捷倫科技有限公司）；液質聯用儀（Agilent 6410 Triple Quad LC/MS，美國安捷倫科技有限公司）。

1.4 動物及分組 SD大鼠，雄性，24只，體質量180～220 g，SPF級，購于南方醫科大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（粵）2011-0015。采用隨機方法將動物分組，每組6只，分別灌胃給予生理鹽水、麻黃堿、麻黃和麻黃-桂枝藥對（3∶2）水煎液。

2 方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 麻黃堿組 精密稱取麻黃堿對照品，加蒸餾水制成4.80 mg/mL的溶液，作為麻黃堿組試液。

2.1.2 麻黃組 稱取麻黃藥材，按麻黃湯原方配比加10倍量水，浸泡30 min。煎煮20 min，去沫。再煎30 min，定容。濃縮至1.50 g/mL，按麻黃堿計為4.80 mg/mL，作為麻黃組試液。

2.1.3 麻黃-桂枝（3∶2）組 稱取麻黃藥材，按麻黃湯原方配比加10倍量水，浸泡30 min。煎煮20 min，去沫。按麻黃湯原方配比加桂枝藥材，煎煮30 min，定容。按麻黃量計濃縮至1.85 g/mL，按麻黃堿計為4.80 mg/mL，作為麻黃-桂枝（3∶2）組試液。

2.1.4 林格氏液的配制 分別稱取4.300 0 g氯化鈉、0.122 1 g氯化鈣、0.149 0 g氯化鉀，加蒸餾水溶解，轉移至500 mL量瓶中，加稀鹽酸調pH 至7.4，定容，0.45 μL濾膜過濾，制得空白林格氏液溶液。

2.2 微透析法收集腦脊液 采用20％烏拉坦（0.6 mL/100 g）麻醉大鼠，插入胃管，固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨。參照《大鼠腦立體定位圖譜》，在前囟前2.6 mm、旁開1.3 mm、硬膜下3.6 mm顱骨上鉆孔，插入腦探針。以1.5 μL/min灌注空白人工腦脊液（林格氏液），平衡2 h。分別灌胃給予各組試藥（1 mL/100 g），采用動物低溫收集器收集透析液樣品，-80℃保存待測。實驗結束后，對大鼠進行心臟灌注，分離取出鼠腦，福爾馬林浸泡固定后，通過切片確定探針所在位置是否準確。若腦內損傷過重或探針膜頭彎曲，摒棄實驗結果［13］。以1∶1比例混合待測透析液和內標溶液后，立即進行LC-MS（液質聯用）分析［14］。

2.3 PK-PD聯合模型分析 采用Winnonlin 4.0.1軟件，分別輸入時間、藥代動力學指標（藥物濃度隨時間的變化）、藥效動力學指標（Glu、GABA含有量隨時間的變化）3組數據，選用線性模型、對數模型及Sigmoid-Emax模型等PK-PD模型進行擬合。根據軟件計算得到的R（相關系數）、AIC （Akaike信息量準則）、SBC（Schwarz信息量準則）等指標選擇最佳藥效動力學模型，比較不同給藥組間的參數差異。

3 結果

3.1 麻黃堿在額葉皮層部位的藥時曲線及Glu和GABA的水平變化 結果表明，不同組別麻黃堿在大鼠額葉皮層的藥代動力學過程基本一致。與生理鹽水組相比，不同組別的Glu、GABA均有不同程度的升高。其中，Glu均在60 min達到峰值，隨著時間推移逐漸下降；麻黃堿組GABA質量濃度在100 min達到峰值，麻黃組和配伍組均在120 min達到峰值，隨著時間推移逐漸下降。見圖1～3。

圖1　麻黃堿藥-時曲線Fig.1 Concentration-time curves of ephedrine

圖2　Glu質量濃度隨時間變化曲線Fig.2 Curves of Glu concentration w ith time

圖3　GABA質量濃度隨時間變化曲線Fig.3 Curves of GABA concentration w ith time

3.2 PK-PD模型分析

3.2.1 不同PK-PD模型擬合的結果 如表1所示，通過PK-PD模型擬合，麻黃堿藥效指標的最佳藥效動力學（PD）模型為Sigmoid-Emax模型，各組AIC、SBC值相對較小，且相關系數較其它模型更接近1。其公式如下。

表1　藥對對麻黃堿PD模型擬合參數的影響Tab.1 Effects of herb pair on PD fitting parameters of ephedrine

其中，E為即時效應值，Emax為最大效應，E0為基礎效應值，ECe50為引起效應達到最大效應一半時的藥物濃度值，C為藥物即時濃度值，S為形狀因子，反映曲線的形狀變化。

3.2.2 藥對配伍對Sigmoid-Emax模型擬合參數的影響 從表2的結果可以看出，麻黃堿組和麻黃組的Glu達峰質量濃度（Emax）均大于配伍組，而ECe50值小于配伍組，說明桂枝的加入抑制了麻黃堿引起的興奮性變化。各組GABA的S值均大于1，說明此時S形曲線的中間部分較陡；而Glu的S值均小于1，說明低質量濃度時曲線較陡，但離開ECe50后，其曲線較平坦，效應接近Emax較慢。

3.2.3 PK-PD模型擬合的E-C曲線 實驗結果如圖4所示，以麻黃堿在大鼠腦脊液中的質量濃度變化為PK指標，以氨基酸類神經遞質含有量的動態變化為PD指標，各組Glu的E-C曲線均呈順時針環，說明各組大鼠給予麻黃堿后均出現了顯著的快速耐受性；各組GABA的E-C曲線均呈逆時針環，說明抑制性氨基酸含有量變化滯后于血藥濃度變化。

4 討論

傳統的藥代動力學（PK）和藥效動力學（PD）研究是分別進行的。其中，藥代動力學研究多是通過測定體內血液的藥物濃度變化來反應藥物在體內的綜合作用特征，無法反應作用部位的特定藥動學特征。而藥效動力學研究則主要在離體水平進行，相關模型往往呈現藥物濃度和效應一一對應的關系，無法反應藥物在體內的真實效應變化。實際上，PK和PD是在體內密切相關的兩個同時進行的動力學過程。前者反應藥物濃度隨時間的變化規律，進而可以推斷藥物的吸收、分布、代謝和排泄特征。后者描述藥理效應隨時間的變化特征，進而推斷作用部位的藥物濃度與藥理效應之間的變化規律。因此，有必要將兩者結合起來同步研究。

麻黃堿是麻黃的主要藥效成分，同時也是麻黃產生興奮性毒副作用的毒性成分。由于麻黃堿分子量較小，因此可以直接通過血腦屏障進入腦區。谷氨酸（Glu）是興奮性氨基酸類神經遞質，而γ-氨基丁酸（GABA）是抑制性氨基酸類神經遞質，兩者的含有量變化可以直接反應動物的中樞神經系統變化。有實驗研究表明，麻黃堿可以引起大鼠腦部氨基酸類神經遞質變化，額葉皮層是影響最大的部位［15］。本實驗采用的腦部微透析采樣技術，可以同時收集反應藥物濃度變化和效應變化的樣品，進一步通過LC-MS/MS等靈敏度較高的分析技術可以測定樣品中微量的麻黃堿和Glu、GABA等效應指標。

目前，常用的PK-PD模型有線性模型、對數線性模型、最大效應模型（Emax）、Sigmoid-Emax模型等。其中，Sigmoid-Emax模型是在研究中使用最多的藥效模型，適用于描述多種藥物在體內的濃度和效應關系。實驗結果表明，以麻黃堿在大鼠腦透析液中的質量濃度變化為PK指標，以氨基酸類神經遞質含有量的動態變化為PD指標，經模型擬合比較符合Sigmoid-Emax模型。PK-PD模型的藥物濃度-效應曲線（E-C曲線）大致可分為3種類型，E-C S形曲線、E-C逆時針滯后曲線和E-C順時針曲線。本實驗研究表明，以大鼠腦透析液中麻黃堿的質量濃度變化為PK指標，以Glu含有量的動態變化為PD指標，給藥后各組E-C曲線均呈順時針，相對于藥物濃度上升期的效應變化，同一藥物濃度在下降期內所對應的效應顯著減弱，說明各組動物均對麻黃堿產生了快速耐受性。以大鼠腦透析液中麻黃堿的質量濃度變化為PK指標，以GABA含有量的動態變化為PD指標，給藥后各組E-C曲線均呈逆時針，相對于達到藥物濃度峰值的時間，藥理效應的峰值顯著滯后，表明引起GABA含有量變化的效應室不在額葉皮層，麻黃堿并不是直接對GABA產生作用，而很有可能是機體對Glu含有量升高的自我調節作用。麻黃-桂枝配伍組與麻黃堿組和麻黃組相比，產生同一效應值藥物濃度較高，說明桂枝對中樞神經的作用與麻黃堿相反，具有下調Glu水平和升高GABA水平的作用。

本實驗通過PK-PD模型擬合，說明以麻黃堿在大鼠腦透析液中的質量濃度變化為PK指標，以Glu、GABA含有量的動態變化為PD指標，最佳PK-PD模型為Sigmoid-Emax模型。E-C曲線表明麻黃堿易于產生耐受性，桂枝可以抑制麻黃堿引起的興奮性變化，這可能是麻黃-桂枝藥對配伍后相對安全的證明。

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［臨 床］

Neuroprotective effect of Cinnamomi Ramulus against ephedrine-induced excitotoxicity in EPhedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pair

ZHENG Fang-hao1， LUO Jia-bo2*
（1.Foshan MuniciPal HosPital of Traditional ChineseMedicine，Foshan 528000，China；2.School of Traditional ChineseMedicine，Southern Medical U-niversity，Guangzhou 510515，China）

ABSTRACT：AIM To study the neuroprotective effect of CinnamomiRamulus against ephedrine-induced excitotoxicity in EPhedrae Herba-CinnamomiRamulus herb pair by pharmacokinetics-pharmacodynamics（PK-PD）modeling.METHODS SD rats received gavage with saline，ephedrine，ephedra and EPhedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pair（3∶2）decoctions.In themicrodialysis，the change of ephedrine concentration in cerebrospinal fluid was taken as a PK index，while the dynamic changes of amino acid neurotransmitterswere taken as PD indexes.RESULTS The best PK-PD modelwas Sigmoid-Emax.Each group of Glu E-C curve showed a clockwise loop，while E-C curve of GABA showed a counterclockwise loop.CONCLUSION Ephedrine has tachyphylaxis，and the excitatory changes induced by ephedrine can be inhibited by Cinnamomi Ramulus.

KEY WORDS：EPhedrae Herba；Cinnamomi Ramulus；herb pair；pharmacokinetics-pharmacodynamics（PKPD）；Glu；GABA；effect-concentration（E-C）curve；rats

*通信作者：羅佳波（1947—），男，教授，從事中藥新藥研發方向研究。Tel：（020）62789112，E-mail：ljb@fimmu.com

作者簡介：鄭芳昊（1987—），男，博士，從事中藥新藥研發工作。Tel：（0757）81092010，E-mail：fanghao-zheng@foxmail.com

基金項目：國家自然科學基金重點項目（81030066）

收稿日期：2015-10-21

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.005

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-0984-05