熱休克蛋白70對HBV復制的影響*

周洪鐘， 劉 波， 任吉華， 陶娜娜， 陳 祥， 李宛蔚， 陳 娟

(重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400016)

熱休克蛋白70對HBV復制的影響*

周洪鐘， 劉 波， 任吉華， 陶娜娜， 陳 祥， 李宛蔚， 陳 娟△

(重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400016)

目的： 探討過表達熱休克蛋白70(HSP70)對乙型肝炎病毒(HBV)復制的影響。方法: 運用RT-qPCR檢測HBV復制對HSP70表達的影響及過表達HSP70對HBV 3.5 kb mRNA的影響；運用Western blot法驗證HSP70過表達效果及過表達HSP70對HBV核心蛋白的影響；RT-qPCR和Southern blot法分析過表達HSP70對HBV復制中間體的影響；運用雙螢光素酶報告系統檢測過表達HSP70對HBV啟動子活性的影響。結果：HBV復制顯著抑制HSP70的mRNA水平。過表達HSP70 抑制HBV復制中間體、3.5 kb mRNA以及核心蛋白的表達，同時抑制HBV核心啟動子的活性。結論：HBV復制抑制HSP70的表達。過表達HSP70 抑制HBV的復制。本研究結果表明，HSP70通過抑制核心啟動子的活性抑制HBV的復制。

熱休克蛋白70； 乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是嚴重的公共衛生問題之一，全世界約有20億人感染HBV，其中約有3億5 000萬人是慢性感染者[1-3]。HBV感染可以引起一系列與HBV相關的肝臟疾病，包括急性或慢性肝炎、肝硬化和肝癌[4]。目前，用于治療乙型肝炎的主要藥物包括干擾素和核苷類似物，然而它們都不能有效消除HBV感染[5]。因此迫切需要探索新的治療乙型肝炎的方案。

熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是一類屬于熱休克蛋白家族的分子伴侶，是一種由應激誘導的保護細胞免受各種環境損害的高度保守蛋白質，其在蛋白質或多肽的折疊、組裝、轉位中起著重要的作用[6-9]。有文獻報道，HSP70是天然免疫系統的預警信號，與免疫性疾病有關[10]；HSP70也是一種強有力的抗凋亡蛋白，通過調節凋亡途徑參與腫瘤形成并調節腫瘤細胞增殖和存活[1-12]；此外，HSP70還可以通過抑制甲型流感病毒核糖核蛋白的活性從而抑制病毒的轉錄和復制[13]。這些發現提示HSP70與病毒感染存在某種關系，但是HSP70與HBV感染之間的直接關系沒有被確定。因此，本課題將通過在HepG2.2.15和HepAD38 2種HBV復制細胞系中過表達HSP70來探究HSP70對HBV復制的調控作用。

材 料 和 方 法

1 細胞和質粒

HepG2.2.15、HepAD38和HepG2細胞購于ATCC；HBV復制質粒pCH9/3091由第三軍醫大學林蘭教授惠贈；pGEM-HBV1.3由德國海德堡大學Protzer教授贈送；HSP70質粒購于OriGene。

2 主要試劑

HSP70抗體購于Santa Cruz；HBV核心蛋白(HBV core protein,HBc)抗體購于Dako；抗GAPDH抗體購于CST；MEM液體培養基購于Corning；胎牛血清購于Gibco；轉染試劑LipofectamineTM2000、TRIzol試劑購自Invitrogen；iScriptTMcDNA合成試劑盒購于Bio-Rad；實時熒光定量PCR熒光染料SYBR Green購于Roche。雙螢光素酶報告系統檢測試劑盒購于Promega。

3 主要方法

3.1 細胞培養和轉染 HepG2細胞培養于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的MEM培養基中。HepG2.2.15和HepAD38細胞培養于含有10%胎牛血清、400 mg/L G418的MEM培養基中。所有細胞在5% CO2、37 ℃培養箱中常規培養。質粒轉染按說明書操作。

3.2 Western blot實驗 轉染后4 d，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞；取30 μg 細胞總蛋白于10% 的SDS-PAGE中分離蛋白；電泳后蛋白轉移至硝酸纖維素膜；5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后再4 ℃過夜孵育相應的 I 抗(用封閉液按1∶2 000稀釋)；TBST洗膜3次后，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠 II 抗(用封閉液按1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次后，用ECL試劑顯影。

3.3 HBV復制中間體提取和Southern blot實驗 轉染后5 d，用0.5 mL裂解緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、1% NP-40、2% sucrose]在37 ℃裂解細胞15 min，離心去除細胞碎片；在上清中加入4×104U/L DNase I和10 mmol/L MgCl237℃孵育4 h；然后加入200 μL 35% PEG-8000(含1.5 mol/L NaC1)，冰浴1 h；4 ℃、12 000 ×g離心5 min，棄上清；加入500 μL蛋白酶K消化液[0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA],45 ℃過夜；然后用酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，70% 乙醇洗滌，TE緩沖液或ddH2O溶解HBV復制中間體。提取出的HBV復制中間體經0.9%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后將凝膠在含有0.5 mol/L NaOH和1 mol/L NaCl 的變性液中變性30 min，然后將DNA樣本轉移到尼龍膜，進行紫外交聯和預雜交，預雜交后將膜在含有地高辛標記的HBV特異性探針的雜交液中42 ℃過夜孵育，用CSPD化學發光。

3.4 RT-qPCR實驗 按照SYBR Green說明書配制體系進行HBV復制中間體定量檢測。HBV的特異性上游引物為5’-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3’，下游引物為5’-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3’。采用TRIzol試劑盒提取各組細胞的總RNA。采用iScriptTMcDNA合成試劑盒合成cDNA。參照SYBR Green試劑盒實驗操作說明以β-actin為內參照進行RT-qPCR。HSP70的上游引物為5’-GCAAAGAACACAGTCCAAGG-3’，下游引物為5’-CCTGTAGGCAACTGCACAAT-3’；HBV 3.5 kb mRNA的上游引物為5’-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3’，下游引物為5’-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3’；β-actin的上游引物為5’-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，下游引物為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。

3.5 螢光素酶報告基因檢測 細胞培養至融合度為80%，將重組雙螢光素酶報告載體pGL3-Sp1、pGL3-Sp2、pGL3-Xp和pGL3-Cp與HSP70或vector共轉染至HepG2.2.15和 HepAD38細胞中，表達海腎螢光素酶的pRL-TK載體作為內參照。細胞培養36 h后，嚴格按照雙螢光素酶報告系統檢測試劑盒提供的說明書操作。

4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HSP70在HBV復制細胞系中的表達水平

首先我們比較了HSP70在HepG2、HepG2.2.15以及HepG2瞬時轉染HBV表達質粒pCH9/3091和pGEM-HBV1.3細胞中的表達水平。RT-qPCR檢測發現HSP70 的 mRNA水平在HBV表達細胞系中顯著低于對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of HSP70 in HBV-expressing cells. The mRNA levels of HSP70 were detected by RT-qPCR in HepG2, HepG2.2.15, and HepG2 cells transfected with pCH9/3091 or pGEM-HBV1.3. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vsHepG2 group;#P<0.05vspcDNA3.1 group.

圖1 HSP70在HBV表達細胞系中的表達水平比較

2 過表達HSP70對HBV復制的影響

為了探討HSP70對HBV復制的影響，我們在HepG2.2.15和HepAD38細胞中瞬時轉染表達HSP70的質粒。Western blot法驗證HSP70過表達是成功的，見圖2。RT-qPCR檢測發現，HBV復制中間體水平在HSP70過表達組顯著低于對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)，Southern blot實驗證實在過表達HSP70后，HBV復制中間體的水平顯著降低，見圖3。RT-qPCR檢測發現過表達HSP70抑制HBV 3.5 kb mRNA的表達，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖4。Western blot實驗結果也發現過表達HSP70能下調HBV核心蛋白的表達水平，見圖5。

Figure 2.The overexpression efficiency of HSP70 in HepG2.2.15 and HepAD38 cells was confirmed by Western blot.

圖2 Western blot法驗證HepG2.2.15和HepAD38細胞系中HSP70過表達效果

Figure 3.The effect of HSP70 overexpression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells on HBV DNA replicative intermediates was analyzed by RT-qPCR (A) and Southern blot (B), respectively. M:marker; rcDNA:relaxed-circular DNA; dsDNA:double stranded DNA; ssDNA:single stranded DNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖3 RT-qPCR和Southern blot法檢測在HepG2.2.15和HepAD38細胞系中過表達HSP70對HBV復制中間體的影響

Figure 4.The effect of HSP70 overexpression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells on HBV 3.5 kb mRNA levels was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖4 RT-qPCR檢測在HepG2.2.15和HepAD38細胞系中過表達HSP70對HBV 3.5 kb mRNA的影響

3 過表達HSP70對HBV啟動子活性的影響

為了進一步分析HSP70影響HBV復制的分子機制，我們在HepG2.2.15和HepAD38細胞中利用雙螢光素酶報告系統分析過表達HSP70對HBV啟動子活性的影響，結果顯示，過表達HSP70抑制了HBV核心啟動Cp的活性，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。因此，以上數據提示HSP70可能通過抑制核心啟動子Cp的活性抑制HBV的復制。

Figure 5.The effect of HSP70 overexpression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells on HBc expression was detected by Western blot.

圖5 Western blot法檢測在HepG2.2.15和HepAD38細胞系中過表達HSP70對核心蛋白的影響

討 論

熱休克蛋白在保護細胞免受應激所致的潛在致死效應中具有重要作用[6-7]，其功能涉及細胞增殖與凋亡、多重耐藥以及P53功能的調節等[14]。根據蛋白質組學分析，HSP70在HBV相關的肝細胞癌發展中發揮了重要作用[15]；有研究報道，HSP70通過阻止核蛋白復合體的核轉位從而抑制甲型流感病毒復制[16]；這提示HSP70在病毒復制調控中發揮了重要作用，因此我們探究了HSP70在調節HBV復制中的作用。本研究中，我們發現HSP70在HBV表達細胞系中顯著下調，過表達HSP70可以顯著抑制HBV復制中間體、3.5 kb mRNA以及核心蛋白的表達。這些結果表明HSP70與HBV的復制密切相關。

Figure 6.Effects of HSP70 overexpression on HBV promoter activity in Hep2.2.15 and HepAD38 were detected by dual luciferase Reporter System. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vsvector group.

圖6 雙螢光素酶報告系統檢測在Hep2.2.15 和HepAD38細胞中過表達HSP70對HBV啟動子活性的影響

之前的研究發現有許多宿主因子參與HBV復制生命周期。HSP(gp96)通過HBx誘導NF-κB激活從而增強HBV的復制[17]；鋅指蛋白是一種固有的宿主抗病毒因子，在轉錄后下調pgRNA從而抑制HBV復制[18]，另外有研究報道,HS3ST3B1通過下調HBV啟動子元件活性從而抑制HBV基因表達和DNA復制[19]；綜上所述，我們推測HSP70可能通過影響HBV基因啟動子活性來調節HBV轉錄和復制。我們在HepG2.2.15和HepAD38細胞中過表達HSP70后發現，HBV核心啟動子Cp的活性明顯下降，與前面結果一致的是，3.5kb mRNA、核心蛋白的轉錄表達正是由核心啟動子Cp調控的。有文獻報道，SIRT1通過激活轉錄因子AP-1與核心啟動子的結合，從而促進HBV的復制[20]；另外，ZEB2可直接結合到HBV核心啟動子上并抑制啟動子的活性，從而抑制HBV的轉錄與復制[21]。因此，我們猜想HSP70可能是通過直接或間接作用于HBV核心啟動子而影響HBV復制與轉錄的。

綜上所述，本研究結果提示HSP70在HBV復制過程中起抑制作用，對乙型肝炎治療方法的發展具有重要意義。然而，HSP70介導的HBV復制調控的詳細機制還需要進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of HSP70 on HBV replication

ZHOU Hong-zhong, LIU Bo, REN Ji-hua, TAO Na-na, CHEN Xiang, LI Wan-yu, CHEN Juan

(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseasesofMinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:yixin_xinyuan@163.com)

AIM: To investigate the role of heat shock protein 70(HSP70)in hepatitis B virus (HBV) replication. METHODS: The effect of HBV replication on the expression of HSP70 was analyzed by RT-qPCR. The overexpression efficiency of HSP70 was confirmed by Western blot. The effect of HSP70 overexpression on HBV DNA replicative intermediates was analyzed by RT-qPCR and Southern blot. The effects of HSP70 overexpression on the expression level of HBV 3.5 kb mRNA and HBV core protein were measured by RT-qPCR and Western blot, respectively. The Effect of HSP70 overexpression on HBV promoter activity was detected by dual luciferase reporter system. RESULTS: The mRNA levels of HSP70 were inhibited by HBV replication. Overexpression of HSP70 repressed the expression of HBV DNA replicative intermediates, 3.5 kb mRNA and core protein, as well as HBV core promoter activity. CONCLUSION: HBV replication inhibits the expression of HSP70. Overexpression of HSP70 represses HBV replication. These data suggest that HSP70 repressed HBV replication by inhibiting HBV core promoter activity.

Heat shock protein 70; HBV

1000- 4718(2016)08- 1425- 05

2016- 03- 10

2016- 06- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 81472271)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.014

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△通訊作者 Tel: 023-68486780；E-mail: yixin_xinyuan@163.com