兩種慢性滲透性腹瀉大鼠模型建立方法的比較*

劉 舒， 高 媛， 肖 露， 楊 亭， 李廷玉， 陳 潔

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究室，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地，重慶 400014)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

兩種慢性滲透性腹瀉大鼠模型建立方法的比較*

劉 舒， 高 媛， 肖 露， 楊 亭， 李廷玉， 陳 潔△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)研究室，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地，重慶 400014)

目的： 比較檸檬酸鎂與乳糖用于建立SD大鼠慢性滲透性腹瀉模型的可行性和實(shí)驗(yàn)適用性，為大鼠慢性滲透性腹瀉模型的建立提供方法學(xué)基礎(chǔ)。方法: 5周齡SPF級(jí)SD大鼠31只，隨機(jī)分為正常對(duì)照(Con)組、檸檬酸鎂腹瀉(Mg)組以及乳糖腹瀉(Lac)組。Lac組用高乳糖飼料喂養(yǎng)，自由飲水；Mg組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲用檸檬酸鎂溶液(鎂離子濃度為4.77 g/L)，不另外給予普通飲用水；Con組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。每天觀測(cè)大鼠的一般情況和腹瀉情況，腹瀉14 d后測(cè)試肌力和自主活動(dòng)度。隨后處死全部大鼠，取結(jié)腸中段檢測(cè)腸黏膜跨腸上皮電阻；取小腸下段和結(jié)腸中段，HE染色觀察腸黏膜病理學(xué)變化。結(jié)果: 兩腹瀉組大鼠均出現(xiàn)體重增長(zhǎng)緩慢、毛發(fā)稀疏無光澤、乏力、活動(dòng)減少等臨床表現(xiàn)，腹瀉率和腹瀉指數(shù)均顯著高于Con組(P<0．05)；Lac組腹瀉指數(shù)明顯高于Mg組(P<0．05)，但Mg組小腸黏膜破壞程度較Lac組稍嚴(yán)重。結(jié)論: 兩種腹瀉模型均能達(dá)到慢性腹瀉的要求，但存在各自的優(yōu)勢(shì)，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇恰當(dāng)?shù)哪Ｐ汀?/p>

慢性腹瀉； 乳糖； 檸檬酸鎂

在我國(guó)，慢性腹瀉是嬰幼兒發(fā)病率很高的疾病，6個(gè)月至2歲的嬰幼兒發(fā)病率最高,1歲以內(nèi)約占50%[1]，對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育及健康危害極大，已成為世界公共性衛(wèi)生問題。慢性腹瀉病因復(fù)雜，包括過敏、感染、免疫缺陷、酶缺陷、藥物及先天畸形等，以急性感染性腹瀉未徹底治療、遷延不愈最為常見[2]。從病理生理學(xué)角度，慢性腹瀉病還可細(xì)分為滲透性腹瀉、分泌性腹瀉、動(dòng)力障礙性腹瀉和炎癥性腹瀉，其中滲透性腹瀉在兒童中相對(duì)常見[3]。目前國(guó)內(nèi)用于研究慢性滲透性腹瀉的動(dòng)物模型只有高乳糖腹瀉法[4]，但存在腹瀉后期乳糖耐受致腹瀉自愈、乳糖吸收不良致其它營(yíng)養(yǎng)素吸收不良等缺陷[5]，不能完全滿足有關(guān)慢性腹瀉的實(shí)驗(yàn)要求。在此，我們以檸檬酸鎂腹瀉法建立另一種慢性腹瀉模型，并與傳統(tǒng)高乳糖腹瀉法進(jìn)行比較，以彌補(bǔ)乳糖慢性腹瀉模型的適用局限性。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及分組

來源于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)成年SD大鼠雌雄各3只，體重300 g左右，按照1∶1的比例合籠，飼喂基礎(chǔ)飼料，待雌鼠產(chǎn)子，子代斷乳后繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼料。幼鼠第6周時(shí)，按照隨機(jī)化分組原則，將其分為正常對(duì)照(control，Con)組、檸檬酸鎂腹瀉(magnesium citrate diarrhea， Mg)組和乳糖腹瀉(lactose enrichment diarrhea，Lac)組，其中，Con組7只，Mg及Lac組均為12只，每組均包括3只雌鼠所產(chǎn)幼鼠。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(渝)2012-0015]，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則進(jìn)行，并通過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要儀器設(shè)備及試劑

大鼠抓力測(cè)試儀、曠場(chǎng)試驗(yàn)箱(瑞沃德生命科技有限公司)、動(dòng)物視頻行為分析系統(tǒng)、Ussing chamber(VCC MC6)、樣本夾片(P2302)、光鏡數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(NIS Elements F4.00.00)；乳糖(上海華茂藥業(yè)有限公司)；檸檬酸鎂(Sigma-Aldrich)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。

3 主要方法

3.1 飼料和檸檬酸鎂溶液的制備 基礎(chǔ)飼料按本課題組研制的配方配制，即每kg飼料中含蛋白質(zhì)200 g、脂肪50 g、葡萄糖680.05 g、CaCO318.00 g、K2HPO421.00 g、CaHPO4·2H2O 1.82 g、MgSO4·7H2O 7.50 g、CuSO4·5H2O 0.018 g、NaCl 10.08 g、KI 0.015 g、ZnSO4·7H2O 0.252 g、MnSO4·H2O 0.138 g、VitE 45.5 mg、VitD 2 176 IU、VitK10.6 mg、VitB15.0 mg、VitB25.0 mg、VitB120.2 mg、VitA 6 500 IU、生物素0.5 mg、葉酸 0.5 mg、煙酸 50 mg、泛酸鈣 50 mg、肌醇 100 mg和氯化膽堿1 000 mg。高乳糖飼料是將基礎(chǔ)飼料中的葡萄糖全部改為乳糖，其余成分保持不變。檸檬酸鎂溶液按鎂離子4.77 g/L的濃度配制。

3.2 慢性腹瀉模型的建立 Lac組以高乳糖飼料喂養(yǎng)，飲用水采用滅菌純凈水；Mg組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，同時(shí)以檸檬酸鎂溶液代替滅菌純凈水飲用；Con組以基礎(chǔ)飼料和滅菌純凈水喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均自由進(jìn)食和飲水。喂養(yǎng)15 d，建立相應(yīng)慢性腹瀉模型。

3.3 腹瀉情況觀察 所有實(shí)驗(yàn)大鼠均以單籠飼養(yǎng)，籠底墊鐵架，每日同一時(shí)間進(jìn)行體重、飲水量測(cè)量和大便觀察。觀察大便的性狀、顏色。對(duì)每只大鼠每天的稀便、干便進(jìn)行計(jì)數(shù)，用分規(guī)和刻度尺測(cè)量每一稀便污跡的直徑。以腹瀉率和腹瀉指數(shù)作為評(píng)判腹瀉的主要指標(biāo)。腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)。稀便率=每只動(dòng)物所排的稀便數(shù)÷該動(dòng)物總便數(shù)。稀便級(jí)表示每只動(dòng)物稀便的程度，以稀便的直徑分級(jí)，分為4級(jí)：<1 cm為1級(jí)，1～1.9 cm為2級(jí)，2～3 cm為3級(jí)，>3 cm為4級(jí)。平均稀便級(jí)=所有稀便級(jí)數(shù)/稀便數(shù)。 腹瀉率(%)=腹瀉的動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100%。

3.4 抓力和自主活動(dòng)度測(cè)試 抓力測(cè)試：將腹瀉14 d后的大鼠置于抓力測(cè)試儀上，當(dāng)它在被人為牽拉尾部向后移動(dòng)時(shí)會(huì)本能地抓住測(cè)試儀上的鐵架以克服后退，當(dāng)外界對(duì)其施加的拉力超過其自身的最大抓力時(shí)會(huì)被拉離抓力測(cè)試儀的鐵架，此時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)記錄抓力的最大值。每一只大鼠重復(fù)上述操作5次，每次測(cè)試之間讓其休息5 s，取5次抓力的平均值[6]。自主活動(dòng)度測(cè)試：測(cè)試前讓大鼠在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的房間適應(yīng)半天。測(cè)試開始時(shí)把大鼠放置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中央?yún)^(qū)，通過動(dòng)物行為分析系統(tǒng)觀察和分析其在曠場(chǎng)試驗(yàn)箱內(nèi)的活動(dòng)情況，每只大鼠測(cè)試10 min，觀察指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)總路程和運(yùn)動(dòng)平均速度。測(cè)試均在下午 1 時(shí)到下午 4 時(shí)之間進(jìn)行。每次測(cè)試結(jié)束后，將大鼠放回籠內(nèi)，清洗曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱底部和側(cè)壁，噴灑少量75%乙醇，待曠場(chǎng)試驗(yàn)箱干燥無異味后方可進(jìn)行下一只動(dòng)物的測(cè)試，每只大鼠測(cè)量1次[7]。

3.5 跨腸上皮電阻測(cè)試 取2 cm長(zhǎng)結(jié)腸中段，將腸腔內(nèi)黏液和腸內(nèi)容物用PBS溶液輕柔漂洗凈，避免損傷腸黏膜，然后將該段腸組織安裝在尤斯灌流室中的Ussing chamber內(nèi)固定，膜兩側(cè)注入飽和的37 ℃ Krebs液10 mL (Krebs液：NaCl 13.67 g、NaHCO34.2 g和葡萄糖3.96 g用雙蒸水1 500 mL溶解，加入STOCK液100 mL定容至2 000 mL，4 ℃保存。STOCK液的配制：CaCl25.56 g、KCl 7.01 g、MgCl2·6H2O 4.88 g和NaH2PO4·2H2O 3.74 g用雙蒸水900 mL溶解，定容至1 000 mL，4 ℃保存)，并且分別在灌流室兩側(cè)勻速通入5% CO2和95% O2組成的混合氣體，開始進(jìn)行腸黏膜跨腸上皮電阻檢測(cè)，每個(gè)樣本測(cè)試時(shí)間為1 h。對(duì)每個(gè)樣本50～60 min區(qū)間段的電阻值進(jìn)行積分，取同組大鼠腸黏膜跨腸上皮電阻平均值[8-9]。

3.6 腸黏膜形態(tài)學(xué)的觀察 剖腹，取2 cm小腸下段，2 cm結(jié)腸中段。用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察腸黏膜病理學(xué)改變。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取4張不連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)垂直、完整的絨毛，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)量絨毛高度[10]和絨毛表面積(r為絨毛的半徑，h為絨毛的高度，單位以mm表示)。上述腸黏膜觀察與腸絨毛測(cè)量均在光鏡放大100倍下進(jìn)行。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組計(jì)量資料測(cè)定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。體重增加百分?jǐn)?shù)由于不符合正態(tài)分布，故在進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后使用一般線性模型中的重復(fù)測(cè)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。體重增加量中的Mg組、自主活動(dòng)速度中的Con組、腹瀉率中的Lac組和Mg組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故使用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異性比較，組間的兩兩比較使用擴(kuò)展t檢驗(yàn)。飲水量變化、抓力、稀便指數(shù)、小腸絨毛高度、小腸絨毛表面積和結(jié)腸跨腸上皮電阻中各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且方差齊，故采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。自主活動(dòng)距離各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，但方差不齊，故選用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。腹瀉率的比較采用行×列表χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠一般情況比較

兩組腹瀉大鼠在腹瀉過程中均可觀察到其精神萎靡，皮毛晦暗、稀疏，肛門口糞便污染、皮毛脫落、腹部膨隆。Mg組大鼠上述表現(xiàn)較Lac組大鼠更為明顯。而Con組大鼠精神良好，皮毛規(guī)整有光澤，肛門口清潔，腹部平坦，見圖1A。

由體重變化百分?jǐn)?shù)可知，不同測(cè)試時(shí)點(diǎn)間體重變化不同，受時(shí)間影響，且3組間存在顯著差異(P<0.05)。Mg組大鼠在腹瀉前4 d，體重均呈負(fù)增長(zhǎng)且體重下降的程度逐漸加重，從腹瀉第5天開始，Mg組大鼠體重波動(dòng)緩慢增長(zhǎng)；而Lac組大鼠在腹瀉前10 d體重均呈負(fù)增長(zhǎng)且體重下降的程度波動(dòng)減輕，從腹瀉第11天開始，Lac組大鼠體重快速增加；Con組大鼠體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均呈穩(wěn)步增長(zhǎng)。從各組大鼠體重變化百分率曲線的斜率可看出Mg組大鼠和Lac組大鼠體重增長(zhǎng)程度均低于Con組大鼠，而Lac組大鼠體重增長(zhǎng)程度低于Mg組大鼠，見圖1B。

由建模第14天體重值減去建模第1天體重值得到造模前后的體重增加值，如圖1C所示，3組動(dòng)物的體重增加值不全相同(P<0．01)，兩腹瀉組大鼠體重增加值均低于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)；盡管Lac組大鼠的體重增值幅度明顯低于Mg組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

3組間飲水量不全相等(P<0．01)。Lac組大鼠飲水量較Con組和Mg組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)。Mg組飲水量與Con組相近，見圖1D。

2 各組大鼠生理狀態(tài)比較

通過抓力測(cè)試比較各組大鼠的肌力，以了解慢性腹瀉是否導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生乏力表現(xiàn)。Lac組和Mg組大鼠的平均抓力均顯著低于Con組(P<0．05)；Lac組大鼠平均抓力與Mg組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

通過曠場(chǎng)試驗(yàn)比較各組大鼠的自主活動(dòng)度，以了解慢性腹瀉后，大鼠是否會(huì)出現(xiàn)活動(dòng)減低的癥狀。兩腹瀉組大鼠10 min內(nèi)自主活動(dòng)距離均較Con組短，但只有Lac組與Con組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)；而Mg組與Lac組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Con組、Mg組和Lac組大鼠自主活動(dòng)速度值不完全相同，兩腹瀉組自主活動(dòng)速度顯著低于Con組(P<0．05)，而Mg組與Lac組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 1.The changes of rat skin, body weight and drinking in both diarrhea groups. A: the hair changes of the rats after diarrhea; B: the changes of body weight in each experimental group; C: body weight gain in the rats; D: water intake of the rats in the experimental groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsMg group.

圖1 兩腹瀉組皮毛、體重和飲水量的變化

Figure 2.The grip strength and motor activity of the rats in the 2 diarrhea groups. Mean±SD.n= 5.*P<0．05vsCon group.

圖2 兩腹瀉組大鼠抓力和自由活動(dòng)能力檢測(cè)

3 腹瀉情況的比較

Lac組和Mg組大鼠均在特殊喂養(yǎng)后24 h內(nèi)出現(xiàn)稀便。Con組呈現(xiàn)黑色顆粒狀成形大便，Mg組稀便表現(xiàn)為似芝麻糊狀黑灰色稀水樣便，而Lac組稀便則表現(xiàn)為類似于蛋花狀的淡黃色稀水樣便，見圖3A。

腹瀉指數(shù)可反映動(dòng)物腹瀉程度。從腹瀉指數(shù)曲線圖可發(fā)現(xiàn)，1～14 d，Con組腹瀉指數(shù)全部為0，兩腹瀉組的腹瀉指數(shù)均顯著高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．01)。Lac組腹瀉指數(shù)呈現(xiàn)“倒U形”變化趨勢(shì)，即先升高后下降；而Mg組則呈現(xiàn)波動(dòng)緩慢上升趨勢(shì)。腹瀉第1天，Lac組腹瀉指數(shù)低于Mg組，第2天兩組腹瀉指數(shù)接近，腹瀉第3天至第12天，Lac組腹瀉指數(shù)均高于Mg組，且在腹瀉的第5、6、7、8天兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在腹瀉第12天，兩組的腹瀉指數(shù)再次接近，隨后在腹瀉的第13天和第14天，Mg組的腹瀉指數(shù)高于Lac組，見圖3B。Lac組與Mg組的總腹瀉指數(shù)均明顯高于Con組(P<0．01)；同時(shí)Lac組的腹瀉指數(shù)仍高于Mg組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)，見圖3C。

從腹瀉率曲線圖可發(fā)現(xiàn)，1～14 d時(shí)Con組腹瀉率全部為0，兩腹瀉組的腹瀉率均顯著高于Con組(P<0．01)。Lac組大鼠腹瀉率在建模第4天至第8天和第10天、第11天達(dá)到100%，Mg組腹瀉率在建模第13天和第14天達(dá)到100%。在建模前2天，檸檬酸鎂致大鼠腹瀉率高于乳糖，從第3天開始，Lac組腹瀉率相比于Mg組平穩(wěn)，且維持在75%以上，從第13天起Lac組腹瀉率低于Mg組，見圖3D。

Figure 3.Comparison of the diarrhea index and diarrhea rate among the 3 groups. A: the comparison of stool character; B: diarrhea index in the experimental groups on each day; C: the total index of diarrhea; D: diarrhea rate of the experimental groups on each day. Mean±SD.n=12.*P<0．05vsCon group;#P<0．05vsMg group.

圖3 各組大鼠腹瀉情況的比較

4 各組大鼠腸組織病理學(xué)和腸黏膜機(jī)械屏障功能的比較

兩腹瀉組大鼠小腸下段、回盲部、結(jié)腸均有液狀或黏稠狀累積物和積氣，并表現(xiàn)為腸腔體積增大，腸組織顏色晦暗。Lac組大鼠腸道內(nèi)累積物為淡黃色水樣或黏稠樣，Mg組大鼠腸內(nèi)累積物為黑灰色黏稠樣。而Con組大鼠腸道內(nèi)少量積氣、腸腔不增大，小腸下段和回盲部有黑灰色半固態(tài)狀累積物，結(jié)腸中下段可觀察到成形的大便顆粒，見圖4A。

光鏡下觀察各組大鼠小腸黏膜發(fā)現(xiàn)，兩腹瀉組較Con組大鼠小腸黏膜肌層變薄，絨毛變短，絨毛頂端上皮細(xì)胞脫落，見圖4B。通過Image-Pro Plus軟件測(cè)量小腸絨毛高度和直徑，計(jì)算其表面積可知，兩腹瀉組小腸絨毛的高度均顯著低于Con組，而Mg組和Lac組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4C。同時(shí)，兩腹瀉組小腸絨毛表面積均顯著低于Con組(P<0.05)，而Mg組和Lac組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4D。

Figure 4. Comparison of the damage state in the rat intestine of the both diarrhea groups. A: the intestine appearance after diarrhea; B: the pathological changes in the intestine (HE staining, ×100); C: intestinal villus height; D: intestinal villus surface area. Mean±SD.n=20.*P<0．05vsCon group.

圖4 兩腹瀉組大鼠小腸損傷程度比較

另外，我們還觀察了各組大鼠結(jié)腸黏膜病理切片，發(fā)現(xiàn)兩腹瀉組結(jié)腸黏膜組織與Con組并無明顯改變，見圖5A。隨后進(jìn)一步用Ussing chamber檢測(cè)大腸黏膜跨腸上皮電阻后發(fā)現(xiàn)，Mg組和Lac組低于Con組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，兩腹瀉組跨腸上皮電阻接近，見圖5B。

討 論

由腹瀉導(dǎo)致的新生兒死亡率高達(dá)17%，對(duì)發(fā)展中國(guó)家5歲以下兒童的生命造成嚴(yán)重威脅，全球每年死于腹瀉病的兒童約有200萬[11]。腹瀉根據(jù)病程可分為急性腹瀉和慢性腹瀉，臨床上將腹瀉時(shí)間超過2周的統(tǒng)稱為慢性腹瀉[12]。在我國(guó)，隨著生活環(huán)境的改善、生活水平的提高，急性腹瀉病(特別是急性重癥腹瀉)有所減少，但慢性腹瀉患兒比例卻有上升趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者調(diào)查表明嬰幼兒遷延性、持續(xù)性腹瀉約占腹瀉病的62.6%[13]。因此，研究慢性腹瀉的發(fā)病機(jī)制、藥物療效、營(yíng)養(yǎng)支持等具有較高的臨床價(jià)值。而建立可靠的慢性腹瀉動(dòng)物模型是進(jìn)行上述各種實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。

Figure 5.The changes of the pathological slice and trans-epithelial resistance in the rat colon among the 3 groups. A: the pathological changes in the colon (HE staining, ×100); B: the intestinal trans-epithelium resistance. Mean±SD.n=6.

圖5 兩腹瀉組大鼠結(jié)腸組織病理切片及跨腸上皮電阻變化

如前所述，兒童以滲透性腹瀉常見。導(dǎo)致持續(xù)滲透性腹瀉的機(jī)制很多，其中包括：腸黏膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙和消化酶異常導(dǎo)致物質(zhì)吸收不良；局部或全身抗原抗體反應(yīng)導(dǎo)致效應(yīng)器介導(dǎo)的腸黏膜物質(zhì)運(yùn)輸異常等。在嬰幼兒期，常見的滲透性腹瀉為：對(duì)碳水化合物吸收不良造成的腹瀉和幼兒過量攝入高滲果汁導(dǎo)致的滲透性腹瀉[14]。本研究將高乳糖和檸檬酸鎂兩種慢性滲透性腹瀉模型進(jìn)行比較，旨在為研究慢性滲透性腹瀉選擇適當(dāng)模型提供參考。

乳糖的消化吸收主要依靠小腸黏膜刷狀緣中乳糖酶數(shù)量及活性。飲食中乳糖成分如果不能在小腸得到充分分解吸收,待其到達(dá)結(jié)腸后即會(huì)被其中的菌群分解代謝。而結(jié)腸內(nèi)過多的未被消化的乳糖代謝成分會(huì)形成高滲環(huán)境，促進(jìn)腸道水、電解質(zhì)分泌，從而引發(fā)腹瀉。高乳糖腹瀉模型是使大鼠攝入超過其消化能力負(fù)荷的乳糖而導(dǎo)致胃腸道癥狀的發(fā)生[15]。國(guó)內(nèi)有研究者利用高乳糖法建立Wistar大鼠慢性腹瀉模型，研究谷氨酰胺對(duì)慢性腹瀉幼鼠腸黏膜修復(fù)的影響[16]。白世敬等[17]用高乳糖加水環(huán)境小平臺(tái)站立建立了功能性腹瀉脾虛癥大鼠模型。

檸檬酸鎂腹瀉模型是給予動(dòng)物飲用高滲且不易被機(jī)體吸收的檸檬酸鎂溶液，從而導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)2周的慢性腹瀉[18]。利用此方法建立慢性腹瀉動(dòng)物模型在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。Teichberg等[19]利用檸檬酸鎂和酚酞的慢性滲透性腹瀉模型發(fā)現(xiàn)阿拉伯膠促進(jìn)腹瀉大鼠空腸吸收口服補(bǔ)液鹽中的鈉和水。Altaf 等[18]利用同樣的模型研究發(fā)現(xiàn)在口服補(bǔ)液鹽中加入鋅可以改善慢性腹瀉動(dòng)物小腸的生理功能，并且有可能減少?gòu)?fù)發(fā)率。國(guó)內(nèi)何珂峻等[20]研究發(fā)現(xiàn)廣金錢草和檸檬酸鎂的存在可能有利于阻止草酸鈣晶體變大形成尿石,也可能誘導(dǎo)了二水合草酸鈣的形成。但目前尚無利用檸檬酸鎂建立慢性滲透性腹瀉的研究報(bào)道。

從我們的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，兩腹瀉組均表現(xiàn)出體重減少、乏力、精神萎靡、活動(dòng)減少、毛發(fā)稀疏無光澤、腹部膨隆等慢性腹瀉的臨床癥狀。另外，乳糖腹瀉組大鼠體重增長(zhǎng)量顯著低于正常對(duì)照組和檸檬酸鎂腹瀉組，表明腹瀉2周后，乳糖腹瀉組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)不良。其原因很可能是飼料中的碳水化合物葡萄糖被乳糖代替，而乳糖不能被大鼠較好吸收和轉(zhuǎn)化成足夠用于生長(zhǎng)所需的能量。有文獻(xiàn)報(bào)道，乳糖不耐受會(huì)導(dǎo)致嬰幼兒微量元素吸收障礙[5]。因此，進(jìn)行微量元素與慢性腹瀉之間相關(guān)機(jī)制研究時(shí)，若采用高乳糖慢性腹瀉模型，很可能對(duì)研究產(chǎn)生較大的影響。而檸檬酸鎂腹瀉組飼料中的碳水化合物——葡萄糖屬于單糖，易被大鼠充分吸收，并轉(zhuǎn)化成足夠能量，因此檸檬酸鎂腹瀉大鼠營(yíng)養(yǎng)不良的程度較輕。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，檸檬酸鎂腹瀉模型可以促進(jìn)氨基酸和寡肽的吸收[21]。因此檸檬酸鎂腹瀉模型在研究營(yíng)養(yǎng)素對(duì)慢性腹瀉的輔助治療作用方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

由于檸檬酸鎂腹瀉組是通過飲水?dāng)z入的，因此我們?cè)跇?gòu)建模型時(shí)考慮了飲水量的比較。乳糖腹瀉組大鼠飲水量顯著高于正常對(duì)照組，原因可能是乳糖造成的高滲狀態(tài)促進(jìn)大鼠飲水，以維持相對(duì)正常的血漿滲透壓。而檸檬酸鎂腹瀉組大鼠在腹瀉的同時(shí)無飲水量的增加，這可能導(dǎo)致大鼠血液濃縮，在測(cè)定血液中某些指標(biāo)時(shí)可能會(huì)存在指標(biāo)偏高，而與該物質(zhì)在機(jī)體中實(shí)際含量存在偏差的情況。因此，測(cè)定腹瀉時(shí)血漿中某些物質(zhì)含量的變化時(shí)，乳糖腹瀉組的測(cè)量結(jié)果更接近于機(jī)體實(shí)際情況。

從腹瀉率和腹瀉程度來看，兩腹瀉組均高于正常對(duì)照組，而兩腹瀉組間差異不明顯。因此，兩腹瀉組均可達(dá)到慢性腹瀉的實(shí)驗(yàn)要求。但乳糖腹瀉組腹瀉指數(shù)曲線圖呈現(xiàn)“倒U形”，提示隨著腹瀉時(shí)間的延長(zhǎng)，該腹瀉組大鼠可能存在乳糖耐受的情況。若實(shí)驗(yàn)需要建立更長(zhǎng)時(shí)間的慢性腹瀉模型，則乳糖腹瀉模型的腹瀉癥狀在實(shí)驗(yàn)后期可能自行緩解而影響實(shí)驗(yàn)。

從形態(tài)學(xué)角度觀察發(fā)現(xiàn)，與乳糖腹瀉組相比，檸檬酸鎂腹瀉組存在更顯著的病理學(xué)改變，這更有利于觀察藥物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)慢性腹瀉腸黏膜的修復(fù)作用。同時(shí)，檸檬酸鎂腹瀉組結(jié)腸黏膜通透性顯著低于正常對(duì)照組，這有利于研究藥物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)慢性腹瀉結(jié)腸機(jī)械屏障功能的改善作用。

另外，在操作上，檸檬酸鎂腹瀉模型較為簡(jiǎn)便，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要任意選擇特殊飼料。而乳糖腹瀉模型由于需將飼料中的碳水化合物成分替換成乳糖，大大增加了工作量，且針對(duì)已加工好的飼料產(chǎn)品更無法實(shí)現(xiàn)替換。因此，兩種慢性腹瀉模型均有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇較能滿足實(shí)驗(yàn)需求的方法。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Comparison of 2 methods for establishing rat model of chronic osmotic diarrhea

LIU Shu, GAO Yuan, XIAO Lu, YANG Ting, LI Ting-yu, CHEN Jie

(Children’sNutritionResearchCenter,ChildrenHospitalofChongqingMedicalUniversity，KeyLaboratoryofChildDeve-lopmentandDisorders,MinistryofEducation，ChinaInternationalScienceandTechnologyCooperationBaseforChildDeve-lopmentandCriticalDisorders,Chongqing400014,China.E-mail:jchen010@cqmu.edu.cn)

AIM: To compare 2 different rat models of chronic osmotic diarrhea with the lactose enrichment and magnesium citrate methods. METHODS: The SD rats (n=31) were randomly divided into lactose enrichment diarrhea group (Lac group, 12 rats), magnesium citrate diarrhea group (Mg group, 12 rats) and normal control group (Con group, 7 rats). The rats in Lac group were fed with a lactose enrichment diet and freely drank water. The rats in Mg group were fed with a standard diet and drank magnesium citrate solution. The Con group was fed with a standard diet and normal water. The general conditions and the characteristics of stool were observed every day. The grip strength and motor activity of the rats were measured after diarrhea for 14 d. The trans-epithelial resistance of the colonic mucosa was detected by Ussing chamber. The pathological changes of villus height and villus surface area in the intestine were observed with hemato-xylin-eosin staining. RESULTS: The rats in both diarrhea groups displayed the clinical manifestations of slow increase in body weight, spare and dull hair, lacking in strength and physical inactivity. The grip strength and motor activity of the rats in both diarrhea groups decreased significantly compared with Con group. The diarrhea rate and diarrhea index of the rats in the 2 diarrhea groups were both significantly higher than those in Con group (P<0．05). Moreover, the diarrhea index in Lac group was significantly increased compared with Mg group. The thickness of intestinal mucosa in Lac group was thinner than that in Mg group at the same time. However, the damage of intestinal villi in Mg group was more serious than that in Lac group.CONCLUSION: Both methods of lactose enrichment-induced diarrhea and magnesium citrate-induced diarrhea meet the requirement of chronic osmotic diarrhea, but there are different advantages between the diarrhea models. Therefore, we should select the correct diarrhea model to meet different aims of the experiments.

Chronic osmotic diarrhea; Lactose; Magnesium citrate

1000- 4718(2016)08- 1484- 08

2015- 12- 24

2016- 05- 30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81470799)； 重慶市渝中區(qū)科委項(xiàng)目(No. 20120210)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.025

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