分化型甲狀腺癌患者術后血清微小RNA-21含量評判預后的臨床價值

曹禮榮，王玉云，邱　涵，王　薇

(1. 湖北中醫藥高等專科學校，湖北 荊州 434020；2. 華中科技大學附屬荊州市中心醫院，湖北 荊州 434020)

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分化型甲狀腺癌患者術后血清微小RNA-21含量評判預后的臨床價值

曹禮榮1，王玉云1，邱涵2，王薇2

(1. 湖北中醫藥高等專科學校，湖北 荊州 434020；2. 華中科技大學附屬荊州市中心醫院，湖北 荊州 434020)

[摘要]目的探討血清微小RNA-21(miRNA-21)含量評估分化型甲狀腺癌(DTC) 術后患者復發/轉移、識別高危風險患者的臨床價值。方法收集DTC患者及良性甲狀腺結節患者(作為良性結節組)的一般情況、個人史、家族遺傳史、職業暴露史、相關既往史等基本情況，并測定血清促甲狀腺激素(TSH)、癌胚抗原(CEA)、降鈣素(CT)、抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)、甲狀腺球蛋白抗體(TG-Ab)、甲狀腺球蛋白(TG)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)、細胞角蛋白多肽-19(CK-19)及miRNA-21含量。所有DTC患者均術后常規隨訪2年，依據隨訪是否出現不良預后事件分為健康組及不良預后組。比較3組患者上述觀察指標的差異性，使用多因素Logistic回歸分析得出影響結局的獨立危險因素，使用皮爾遜積矩相關系數(PPMCC)分析miRNA-21與其他獨立危險因素是否具有相關性，通過受試者工作特征曲線(ROC curve)評估該指標對于DTC患者不良預后的預測價值及臨界值；根據其預測臨界值，將DTC患者分為臨界值以上組及以下組，使用卡普蘭-邁耶曲線(KM curve)驗證2組患者不良預后發生率是否具有差異性，從而識別高危風險的DTC患者。結果健康組51例、不良預后組10例、良性結節組57例，3組間HT病史、GD病史、職業暴露史、家族遺傳史及血清TPO-Ab、TG-Ab、TG、CT、CEA、CK-19、miRNA-21水平比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；多因素Logistic回歸顯示TPO-Ab、TG-Ab、CT、CK-19、miRNA-21是DTC患者術后2年內發生不良預后事件的獨立危險因素；其中miRNA-21與TPO-Ab、CT、CK-19均呈正相關(r=0.538, 0.604，0.522，P均<0.05)，與TG-Ab無顯著相關性(r=0.371, P>0.05)；該指標ROC曲線的AUC為0.748，95%CI(0.707，0.814)，最佳預測值為8.19 ng/mL；根據miRNA-21的最佳預測值，臨界值以上的DTC術后患者2年內并發不良預后事件的比率明顯增高(P<0.05)， KM生存曲線亦證實上述研究結果。結論血清miRNA-21含量對于評估DTC術后復發/轉移情況、識別高危風險DTC患者具有重要意義。

[關鍵詞]分化型甲狀腺癌；微小RNA；不良預后

甲狀腺癌是近20多年發病率增長最快的惡性實體腫瘤，據美國相關流行病學調查資料顯示，近年來總體發病率平均增長6.2%[1]，已成為當前內分泌系統、頭頸部最為常見的惡性腫瘤。其中約90%的甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌(DTC)，其由乳頭狀癌及濾泡狀癌構成，前者發病率逾越70%，后者發病率約為15%[2-3]。兩類DTC患者發病年齡普遍較輕，起病早期多無明顯自覺癥狀，病情進展緩慢，由于該病惡性程度相對較低，因而外科治療后的預后相對較好[3]。但不容忽視的是，DTC具有術后易于復發的特點，且隨著超聲影像技術的進步，相關檢出率不斷提升，10%～20%的DTC患者術后5年內出現不同程度的復發及轉移，顯著影響患者預后[4]。因而對于手術后的DTC患者進行有效危險分層，從而及時干預高危預后的患者，可有效降低腫瘤轉移及復發的發生概率[5]，改善預后，亦能有效節約醫療資源。但是，當前臨床對于術后DTC是否復發/轉移的預判識別主要依賴于相關血清腫瘤標志物的檢查，受患者年齡、性別、機體內分泌情況[6]、術中腫瘤組織侵犯情況[7]、術后是否接受放射性核素治療[8]等多重因素干擾，相關標志物對于早期評判DTC患者是否復發/轉移并進行精確危險分層的價值差強人意。基于上述臨床背景，近年來微小RNA(miRNA)與甲狀腺腫瘤之間存在的關聯逐漸得到學術界重視。miRNA為非編碼的單鏈小RNA分子，由18-27核苷酸組成，屬于短鏈非編碼RNA[9]。miRNA作為潛在癌基因及抑癌基因，通過轉錄后調控機制抑制靶基因表達，從而可用于癌癥的診斷[10]。其中miRNA-21被認為是miRNA轉錄的主要驅動因子，通過調控PDCD4、PTEN、SMARCA4、TPMl、TIMP3、ANP32A等位點，在多種實體腫瘤中呈現高表達，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡。但由于既往文獻并未就血清miRNA-21含量與DTC患者不良預后的相關性進行研究，且缺乏該指標是否可以評判DTC預后轉歸的依據，因此筆者擬設計長周期臨床研究進行探討，從而為下階段的大樣本、多中心研究提供理論依據。

1臨床資料

1.1研究對象選擇荊州市中心醫院2012年7月1日—2013年7月1日連續收治的DTC和良性甲狀腺結節患者，均于術中行快速冰凍切片以明確病情，DTC患者均接受甲狀腺癌根治術，且術后1個月完成放射性131I清除殘留甲狀腺治療。上述診療過程均符合《甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌診治指南(2012版)》[11]。排除既往有頸部手術且對局部解剖結構產生明顯影響者；頸部最大結節直徑≥4 cm的占位性病變者；甲狀腺癌已并發遠端轉移者；術中見腫瘤浸潤淋巴結或血管者；嚴重的凝血功能異常者；術中無法全部切除腫瘤組織者；年齡≥65歲者；術后全身131I顯像發現有異常放射性攝取者。剔除后續隨訪過程中出現伴發難以控制的全身性感染者，因其他疾病需要大劑量糖皮質激素治療者，新發其他惡性腫瘤者，嚴重創傷、多發傷、復合傷者。本次研究符合赫爾辛基宣言及中國臨床試驗研究的相關法規，所有受試患者入選前均已簽署知情同意書或授權家屬簽署，所有患者獲取知情同意書的過程亦符合臨床試驗研究的質量管理規范要求。

1.2研究方法收集所有入選者的個人史(抽煙或碘攝入異常或激素依賴)、家族遺傳史、職業暴露史(電離或輻射)等基本情況，了解既往是否合并有橋本甲狀腺炎(HT)、毒性彌漫性甲狀腺腫(GD)等相關疾病，記錄術中頸部最大結節的直徑。并于清甲完成后1周內，清晨空腹狀態下，抽取靜脈血液標本(良性甲狀腺結節患者相關資料取術前檢查結果)，采用免疫化學發光法測定促甲狀腺激素(TSH)、癌胚抗原(CEA)、降鈣素(CT)含量，試劑盒由武漢市博士德生物公司提供；使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)、甲狀腺球蛋白抗體(TG-Ab)、甲狀腺球蛋白(TG)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)含量，試劑盒購自美國Phoenix Pharmaceutical公司；采用電化學發光法測定細胞角蛋白多肽-19(CK-19)含量，試劑盒為相應配套試劑盒；使用ABI7500熒光定量PCR儀測定miRNA-21含量，根據miRNA cDNA首鏈合成試劑盒說明書提取RNA進行逆轉錄，最終數據用2-△△ct法進行分析。實驗所需的miRNA提取試劑盒、cDNA首鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司。于2014年7月1日—2015年7月1日，電話通知患者前來復查以完成術后隨訪。所有患者的隨訪時間均不少于2年，隨訪終點事件為DTC患者術后是否發生不良預后轉歸事件(復發/轉移)。按照隨訪結果將DTC患者分為健康組及不良預后組，將良性甲狀腺結節患者作為良性結節組，比較3組相關統計指標的差異性；使用多因素Logistic回歸分析校正上述組間相關指標資料，以得出影響結局的獨立危險因素；使用皮爾遜積矩相關系數(PPMCC)分析上述獨立危險因素指標與miRNA-21是否具有相關性；進一步使用受試者工作特征曲線(ROC curve)評估miRNA-21是否具備預測DTC患者發生不良預后的檢驗效能，計算出最佳預測臨界值及其敏感性及特異度；如miRNA-21可用于預測DTC患者的預后轉歸，則根據最佳預測臨界值，將DTC患者分為臨界值以上組及以下組，使用卡普蘭-邁耶曲線(KM curve)觀察2組患者的不良預后發生率，以進一步驗證其中是否存在差異性，從而早期識別術后高危風險的DTC患者。

2結果

2.1納入患者情況共納入61例DTC患者，男19例，女42例；年齡(40.37±9.12)歲。累計6例患者失訪，其中3例患者更換手機號碼失聯、2例患者遷至外地、1例患者因股骨頭置換術入院無法配合隨訪，總體失訪率為9.83%。最終55例患者完成隨訪，其中健康組47例,不良預后組8例。納入良性甲狀腺結節患者57例。

2.2健康組、不良預后組及良性結節組各觀察指標比較3組間HT病史、GD病史、職業暴露史、家族遺傳史及血清TPO-Ab、TG-Ab、TG、CT、CEA、CK-19、miRNA-21水平比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，其余指標比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.3影響DTC不良預后的獨立危險因素使用多因素Logistic回歸模型進一步校正上述組間比較差異有統計學意義的指標，結果顯示TPO-Ab、TG-Ab、CT、CK-19、miRNA-21是DTC患者術后2年內發生不良預后事件的獨立危險因素(P均<0.05)。見表2。

2.4miRNA-21與其他具有差異性指標相關性分析PPMCC檢驗驗證顯示：miRNA-21與TPO-Ab、CT、CK-19均呈正相關(r=0.538,0.604，0.522，P均<0.05)，與TG-Ab無顯著相關性(r=0.371,P>0.05)。

表1　2組DTC患者術后組間資料的比較

表2　DTC患者相關危險因素多因素Logistic回歸分析結果

2.5miRNA-21預測DTC患者不良預后的價值以靈敏度為縱坐標、以誤診率(1-特異度)為橫坐標，繪制ROC曲線以評判miRNA-21作為獨立危險因素對于DTC患者術后2年內出現不良預后事件的預測價值：ROC曲線的AUC為0.748，95%CI(0.707，0.814)；miRNA-21最佳預測臨界點的靈敏度為60.27%，特異度為73.69%；miRNA-21最佳預測值為8.19 ng/mL。見圖1。

圖1　miRNA-21預測DTC患者術后2年內

2.6驗證miRNA-21對于高危DTC患者的判斷價值根據miRNA-21的最佳預測值，將所有DTC患者再分為臨界值以上組(n=11)及臨界值以下組(n=44)。根據隨訪結果，發現臨界值以上組患者2年內并發不良預后事件的比率為63.63%(7/11)，臨界值以下組患者2年內并發不良預后事件的比率為2.27%(1/44)，即miRNA-21≥8.19 ng/mL時，DTC術后患者于2年內并發不良預后事件的比率明顯增高(2=17.106,P<0.05)。繪制KM曲線，亦可見臨界值以下組的不良預后發生率較臨界值以下組明顯降低。見圖2。

圖2　不同miRNA-21臨界值組DTC患者術后2年內

3討論

腫瘤的發生、發展機制非常復雜，涉及多種癌基因、抑癌基因和信號轉導通路的改變。miRNA通過細胞早期發育、增殖、分化、凋亡、代謝等途徑，廣泛參與生命活動中的系列進程。miRNA-21是一種具有癌基因特性的促癌miRNA，其基因位于染色體17q23.2，在許多腫瘤中都存在異常表達，可作為腫瘤發生、發展過程中的重要調控因素[12]。Chang等[13]首次發現miRNA-21在人類惡性膠質瘤中呈現高表達，并通過抑制細胞凋亡促進腫瘤的發生；張建龍等[14]研究證實，miRNA-21是結腸癌中表達上調最常見的miRNA；Lawrie等[15]通過臨床試驗發現，B細胞淋巴瘤患者血清miRNA-21含量明顯高于健康人，且增高程度與復發率和生存率密切相關。

本研究發現miRNA-21是DTC術后并發不良事件的敏感指標；通過多因素Logistics回歸分析進一步排除其他因素干擾、校正各項危險因素對于結局的影響，發現miRNA-21與TPO-Ab、TG-Ab、CT、CK-19均為DTC術后患者不良預后的獨立危險因素。筆者查閱相關指南發現，CT對于評判DTC患者是否具有淋巴管或遠處轉移風險具有相當好的同步性，術前若CT>100 ng/L，則遠處轉移的概率較高，術后CT水平仍高于正常水平的患者多有腫瘤殘存，易于復發；此外，檢測TG-Ab對判斷DTC復發或殘留的敏感性與特異性最高，該指標是提示腫瘤持續存在的高度敏感指標[16]。本研究使用PPMCC驗證miRNA-21含量與其他危險因素含量的相關性，發現miRNA-21與TPO-Ab、CT、CK-19均呈顯著正相關，表明miRNA-21含量用于評判DTC患者術后復發/轉移具有一定的臨床價值。再以miRNA-21作為獨立危險因素繪制ROC曲線，用于評判該指標對于DTC術后患者不良預后的預測效能，發現該ROC曲線的AUC為0.748，說明miRNA-21用于評判預后具有較高的預測價值，其預測臨界值為8.19 ng/mL；進一步分組比對發現，高于臨界值的DTC術后患者，其不良預后轉歸發生率遠遠高于低于臨界值的DTC術后患者；結合KM曲線結果充分驗證了miRNA-21含量對于DTC術后患者不良預后的預測價值，即高于此臨界值的DTC術后患者具有更高的不良預后風險。

限于本次研究的周期較短，納入樣本的數量偏少，研究結果難免存在局限性；且本研究為單中心研究，并未就不同手術者、不同藥物干預對于具體指標的動態波動進行監測，但通過本研究可以得出以下結論：①血清miRNA-21含量是對DTC術后不良預后診斷體系的有效補充；②血清miRNA-21含量可用于評估DTC患者的預后轉歸；③8.19 ng/mL為血清miRNA-21預測DTC不良預后的臨界值，高于該臨界值的DTC患者具有更高的不良預后風險。

綜上所述，血清miRNA-21含量對于評估DTC術后復發/轉移情況、識別高危風險DTC患者具有重要意義，具備廣闊的應用前景，但該指標的應用時間尚短，相關實驗研究和臨床應用還需進一步深化，以期更好的指導臨床應用。

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Clinical value of miRNA-21 level on prognosis evaluation for patients with differentiated thyroid cancer after surgery

CAO Lirong1, WANG Yuyun1, QIU Han2, WANG Wei2

(1. Hubei College of Chinese Medicine, Jingzhou 434020, Hubei, China; 2. The Affiliated Jingzhou Central Hospital of Huazhong University of Science and Technology, Jingzhou 434020, Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the clinical value of miRNA-21 level on the evaluation for recurrence and metastasis of differentiated thyroid carcinoma (DTC) and the recognition of the high risk patients. Methods The basic information of DTC patients and benign thyroid nodules patients include general situation, personal history, family history, occupational exposure, related past history were collected, and the levels of thyroid stimulation hormone (TSH), carcinoembryonic antigen (CEA), calcitonin (CT), anti-thyroid peroxidase antibodies (TPO-Ab), thyroglobulin antibodies (TG-Ab), thyroglobulin (TG), three free triiodothyronine (FT3), free four triiodothyronine (FT4), cytokeratin polypeptides-19 (CK-19) and miRNA-21 were detected in all patients. All DTC patients were divided into health group and poor prognosis group according to the results of follow-up for 2 years. The data were compared among the three groups. The independent risk factors of affect the outcome were analyzed by multivariate logistic regression analysis; the correlation of miRNA-21 and other independent risk factors were analyzed by Pearson product moment correlation coefficient (PPMCC) analysis; the predictive value and critical value of these indexes on poor prognosis of DTC patients were evaluated by the receiver operating characteristic (ROC) curve; and based on its prediction of critical value, the evaluation value on the incidence of poor prognosis were verified by the Kaplan-Meier (KM) curve. Results There was 51 cases in healthy group, 10 cases in poor prognostic group and 57 cases in thyroid nodules group. There were significant differences among the three groups in HT history, GD history, occupational exposure history, family history, and the levels of TPO-Ab, TG-Ab, TG, CT, CEA, CK-19, miRNA-21 (all P<0.05). Multivariate Logistic regression analysis showed that the levels of TPO-Ab, TG-Ab, CT, CK-19 and miRNA-21 was an independent risk factor for poor prognosis in patients with DTC events after 2 years; which, miRNA -21 was positively correlated with TPO-Ab (r=0.538, P<0.05), and CT (r=0.604, P<0.05), and CK-19 (r=0.522, P<0.05); but no correlated with TG-Ab (r=0.371, P>0.05). The AUC of ROC curve was 0.748, 95%CI(0.707, 0.814), the best predictive value was 8.19 ng/mL; accordance with the best predictive value of miRNA-21, the concurrent poor prognosis events ratio of 2 years in DTC patients above the threshold was significantly higher (P<0.05), KM survival curves also confirm these findings. ConclusionSerum miRNA-21 levels has an important significance on the evaluation for recurrence and metastasis of differentiated thyroid carcinoma (DTC) and the recognition of the high risk patients.

Key words:differentiated thyroid carcinoma; micro RNA; poor prognosis

[收稿日期]2015-11-10

[中圖分類號]R736.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)12-1264-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.12.004

[作者簡介]曹禮榮，男，主治醫師，講師，主要研究方向為甲乳外科疾病。[通信作者]王玉云，E-mail：dagou_001@163.com