耐力訓(xùn)練對心肌PERK/eIF2α/ATF4信號通路激活的影響

王蘊紅 王智強 劉曉然 陳怡月 李丁丁 余海燕 姚政立

摘要：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制在耐力訓(xùn)練對心肌功能影響過程中的作用。方法：通過建立不同運動方式、運動訓(xùn)練狀態(tài)和不同恢復(fù)階段的動物模型，測定心肌中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的信號通路PERK/eIF2α/ATF4激活水平的變化。結(jié)果：無論是急性運動，還是4 或10周的遞增負荷耐力訓(xùn)練，都沒有顯著激活PERK/eIF2α/ATF4信號通路，但是以延長運動時間為特征的耐力訓(xùn)練能夠激活PERK/eIF2α/ATF4 信號通路。結(jié)論：以遞增運動時間為特征的耐力訓(xùn)練能夠激活PERK/eIF2α/ATF4信號通路，該通路的激活對運動心肌的結(jié)構(gòu)和功能變化可能產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞： 運動；心肌；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；真核起始因子2α；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子4

中圖分類號： G 804.2 文章編號：1009783X（2016）03027404 文獻標志碼： A

Abstract：This study sets to investigate the effect of endurance training on the cardiac muscles，and identify if endoplasmic reticulum stress is involved in the process of functional and structural changes.Methods：We established animal models of different exercise types，training status，and recovery periods in order to study the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway.Results：Neither a single bout nor 4 or 10 weeks of endurance training induced the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway.However，duration-increased endurance training significantly activated the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway.Conclusion：Endurance exercise that characterized with durance increase induced the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway that might play role in the process of functional and structural changes.

Keywords：exercise；cardiac muscle；endoplasmic reticulum stress；PERK；eIF2α；ATF4

研究顯示，耐力訓(xùn)練可激活A(yù)kt/mTOR信號通路，引起心肌蛋白質(zhì)合成提高和心肌肥大[1]；然而長期遞增負荷的訓(xùn)練，Akt/mTOR信號通路并沒有都顯示持續(xù)性的激活，心肌也未呈現(xiàn)顯著肥大，這提示運動誘發(fā)心肌結(jié)構(gòu)的變化還受其他調(diào)節(jié)機制影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)翻譯、折疊、修飾過程中，發(fā)揮重要的作用[2]。而當(dāng)細胞在低氧和營養(yǎng)缺失等因素的作用下，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過UPR起到對細胞的保護作用，這些反應(yīng)包括暫停早期蛋白質(zhì)合成、降解[3]。 新近的研究也顯示，運動訓(xùn)練可導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[4]。那么，在運動訓(xùn)練中的心肌是否會出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR？已知信號通路PERK（PKR like ER kinase）/Eukaryotic initiation factor（eIF）2α/Activating transcription factor（ATF）4的激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)[5]；因此，本研究擬通過建立不同訓(xùn)練水平和恢復(fù)期，以及不同訓(xùn)練方式的大鼠運動模型，觀察PERK/eIF2α/ATF4的激活變化，以揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了運動誘發(fā)的心肌結(jié)構(gòu)變化。

1 研究方法

1.1 實驗方法

8周雄性SPF級SpragueDawley大鼠134只，購自北京維通利華實驗動物有限公司。本研究采用了2個運動訓(xùn)練方案。第1個運動訓(xùn)練方案（108只大鼠，每組7～10只）是使大鼠分別進行一次遞增負荷運動、4周和10周的運動訓(xùn)練。急性運動參照Bedford[6]的運動模型建立；4周和10周的運動訓(xùn)練模型則參照本實驗室以往耐力訓(xùn)練模型建立[7]，即起始速度為12 m/min，每周速度遞增約3 m/min，10周的運動訓(xùn)練動物在前4周的運動訓(xùn)練方案同4周訓(xùn)練模型，之后繼續(xù)遞增運動速度直到10周訓(xùn)練結(jié)束，使10周末速度遞增達到34～36 m/min。模型建立后，動物末次運動后在指定時間點（0 h，3 h，24 h）取材，分離左心室。第2個運動方案是建立5周運動訓(xùn)練模型（26只大鼠，每組5～7只），所有運動組大鼠先完成為期3周的速度遞增，每天1 h耐力訓(xùn)練后，使運動速度從12 m/min達到24 m/min，再分組進行2周的訓(xùn)練。其中1組（C）維持速度時間不變，而另外2個組則分別進行速度遞增（S）、時間遞增（D）的運動訓(xùn)練（見表1），運動組大鼠在末次訓(xùn)練后24 h與對照組大鼠（Con）同時處死，取左心室心肌。PERK、pPREK、eIF2α、peIF2α、ATF4、GAPDH 購自Abcam 公司。采用western blot 方法測定心肌相應(yīng)的指標。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤差表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行雙因素方差分析，組間比較采用t檢驗，檢驗標準為P<0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 耐力訓(xùn)練大鼠后心重/體重變化

采用第1個運動方案建立的訓(xùn)練模型中，10周運動組大鼠心重/體重與對照組相比，顯著提高，見表2。而采用5周運動訓(xùn)練方案訓(xùn)練的大鼠，只有速度遞增組與對照組相比，心重/體重顯著升高，見表3。

2.2 急性運動對PERK/eIF2α/ATF4信號通路的影響

結(jié)果顯示，一次急性運動后，心肌的PERK/eIF2α信號通路的激活水平與相應(yīng)的對照組比較，沒有顯著改變，大鼠心肌ATF4的蛋白水平在運動后3 h表達升高（P<0.05），如圖1所示。

2.3 4周運動對PERK/eIF2α/ATF4信號通路的影響

經(jīng)過4周遞增速度運動訓(xùn)練后，大鼠心肌信號通路PERK/eIF2α/ATF4的激活水平無明顯影響，如圖2所示。

2.4 10周運動訓(xùn)練對PERK/eIF2α/ATF4信號通路的影響

結(jié)果顯示，經(jīng)過10周遞增速度運動訓(xùn)練后，大鼠心肌信號通路PERK/eIF2α/ATF4的激活水平?jīng)]有明顯變化，如圖3所示。

2.5 不同運動速度和運動持續(xù)時間對PERK/eIF2α/ATF4信號通路的作用

在5周遞增運動速度、恒速和遞增運動持續(xù)時間3種不同的運動方案中，無論是增速、恒速還是延長運動時間的運動訓(xùn)練，pPERK/PERK水平均未發(fā)生顯著改變。而與此相反，在遞增運動速度和遞增運動時間的耐力訓(xùn)練后，peIF2α/eIF2α水平都顯著提高（P<0.05；P<0.001），延長時間的運動訓(xùn)練比增速運動更高，但是恒速運動與對照組比較，無顯著改變。ATF4表達在運動時間遞增的耐力訓(xùn)練的心肌，表達顯著提高（P<0.05），如圖4所示。

3 分析與討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)細胞蛋白質(zhì)翻譯、折疊、細胞鈣離子調(diào)控等的重要細胞器，它參與了細胞的應(yīng)激反應(yīng)[89]；但以往的研究顯示，短期（8周）的中等強度耐力訓(xùn)練對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達無明顯影響[10]，這提示非大強度、大負荷的運動訓(xùn)練過程中心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)不明顯。因而，本研究首先采用了逐漸遞增運動速度的模型訓(xùn)練，以達到短期耐力訓(xùn)練及長期耐力訓(xùn)練3個不同的運動狀態(tài)，觀察大鼠心肌恢復(fù)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路PERK/eIF2α/ATF4激活的動態(tài)變化，結(jié)果顯示無論是急性運動，還是4周、10周的訓(xùn)練，PERK/eIF2α都不發(fā)生激活變化。進一步說明，較長的訓(xùn)練非極量遞增速度的耐力訓(xùn)練，心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也不明顯。

然而，進一步研究比較運動速度和運動時間分別增加對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路的影響時發(fā)現(xiàn)，遞增運動速度和遞增運動時間的耐力訓(xùn)練，都使peIF2α/eIF2α水平提高，而以延長運動時間的訓(xùn)練提高更明顯。心肌ATF4蛋白的表達也是以運動時間延長的耐力運動最為顯著，這說明運動負荷的提高，尤其是延長時間的運動訓(xùn)練，可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。新近研究也顯示，運動訓(xùn)練可誘導(dǎo)骨骼肌出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認為是細胞線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)改善所必需的，而過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可能導(dǎo)致肌肉損傷和細胞死亡[11]。

目前，有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生機制還不十分清楚。有研究顯示，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的信號通路中，PERK所介導(dǎo)的信號通路在誘發(fā)心肌細胞凋亡等改變中，較其他諸如 IRE1、ATF6等相關(guān)的信號通路起到更為重要的作用[12]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78 解離，并通過胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域的自身二聚化和磷酸化而激活，激活的PERK使eIF2α發(fā)生磷酸化，從而減緩或暫停了蛋白質(zhì)的合成；同時，磷酸化的eIF2α又選擇性地上調(diào)ATF4 mRNA的翻譯，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子基因轉(zhuǎn)錄，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)態(tài)，有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘發(fā)的自噬對心肌的缺血再灌注損傷有保護作用[13]。但長期過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，ATF4上調(diào)CHOP表達，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡[8-9]。實驗顯示，CHOP和Caspase 12的表達在上述各個運動組中并沒有升高，表明該內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并沒有導(dǎo)致運動心肌的凋亡；因此，運動誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路激活的生理意義可能在于減少新合成蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對新蛋白質(zhì)折疊需求的壓力，以便維持細胞穩(wěn)態(tài)。但運動訓(xùn)練中哪些因素誘發(fā)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路激活，還需要進一步研究。

我們以往的研究也證實，在遞增速度的耐力訓(xùn)練中，Akt/mTOR信號通路只出現(xiàn)短期的激活，而隨著運動訓(xùn)練強度的逐漸增大，Akt/mTOR信號通路的活性不再提高。有研究顯示，PI3K/Akt信號通路對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78的表達和穩(wěn)定性有重要影響[14]。那么，PI3K/Akt信號通路是否參與了運動心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，以及心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激降低蛋白質(zhì)合成是否參與了心肌結(jié)構(gòu)變化的調(diào)節(jié)，有待進一步研究。此外，我們以往的研究顯示，10周遞增負荷耐力訓(xùn)練的大鼠心肌自噬標志蛋白表達提高，而運動訓(xùn)練引起自噬的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否有關(guān)，也需要進一步證實。

4 結(jié)論

通過研究不同訓(xùn)練水平及不同方式的耐力運動訓(xùn)練對大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路PERK/eIF2α/ATF4激活的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：非極量負荷的遞增耐力訓(xùn)練不能引起PERK/eIF2α/ATF4信號通路的激活，而以延長時間為特征的耐力訓(xùn)練，能夠激活eIF2α/ATF4信號通路。該通路激活的機制對運動心肌的結(jié)構(gòu)和功能的作用，需要進一步加以研究。

參考文獻：

[1]KEMI O J，CECI M，WISLOFF U，et al.Activation or inactivation of cardiac Akt/mTOR signaling diverges physiological from pathological hypertrophy[J].J Cell Physiol，2008（214）：316.

[2]HETZ C.The unfolded protein response：controlling cell fate decisions under ER stress and beyond[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（2）：89.

[3]KIM I，XU W，BEED J C.Cell death and endoplasmic reticulum stress：disease relevance and therapeutic opportunities[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2008，7（12）：1013.

[4]PEREIRA B C，DA ROCHA A L，PINTO A P，et al.Excessive eccentric exerciseinduced overtraining model leads to endoplasmic reticulum stressin mice skeletal muscles[J].Life Sci，2016（145）：144.

[5]DIANE R F，CONSTANTANTINOS K.The PERKeIF2αATF4 module of the UPR in hypoxia resistance and tumor growth[J].Cancer Biol Ther，2006，5（7）：723.

[6]BEDFORD T G，TIPTON C M，WILSON N C，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol 1979（47）：1278.

[7]王蘊紅，趙明華，梁蕾，等.耐力訓(xùn)練對大鼠心肌JAKs和SOCSs表達的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（2）：181.

[8]郭智東，王弋，許國根.心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究進展[J].心血管病防治，2014，14（1）：48.

[9]陶天琪，劉秀華.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合應(yīng)激反應(yīng)：生理科學(xué)進展[J].2013，44（4）：241.

[10]MURLASITS Z，LEE Y，POWERS S K.Shortterm exercise does not increase ER stress protein expression in cardiac muscle[J].Med Sci Sports Exerc ，2007，39（9）：1522.

[11]OST M，COLEMAN V，KASCH J，et al.Regulation of myokine expression：Role of exercise and cellular stress[J].Free Radical Biology and Medicine ，2016（2） ：17.

[12]LIU Z W，ZHU H T，CHEN K L，et al.Protein kinase RNAlike endoplasmic reticulum kinase （PERK） signaling pathway plays a major role in reactive oxygen species （ROS）mediated endoplasmic reticulum stressinduced apoptosis in diabetic cardiomyopathy[J].Cardiovasc Diabetol，2013（12）：158.

[13]PETROVSKI G，DAS S，JUHASZ B，et al.Cardioprotection by endoplasmic reticulum stressinduced autophagy[J].Antioxid Redox Signal，2011，14（11）：2191.

[14]劉友平，嚴冬梅，陳川寧，等.PI3K/Akt調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對GRP78的誘導(dǎo)[J].中國病理生理學(xué)雜志，2011，27（4）：749.