抗感黃曲霉花生種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)與指紋圖譜構(gòu)建

閆彩霞 張浩 張廷婷 趙小波 李春娟 單世華 孔令讓

摘要：為明確抗感黃曲霉花生種質(zhì)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，發(fā)掘優(yōu)良抗性種質(zhì)，本研究利用46對(duì)多態(tài)性SSR引物分析48份抗感黃曲霉或相關(guān)花生種質(zhì)的遺傳多樣性，平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出5.15個(gè)等位變異，平均PIC值為0.604；聚類分析將48份種質(zhì)分為8組，其中抗性種質(zhì)被分成5組；低產(chǎn)毒種質(zhì)91048、抗侵染種質(zhì)AR-3、PI337409F和GFA-2以及抗圓柱狀黑腐病種質(zhì)PERRY與其它種質(zhì)存在較大的遺傳差異，可作為理想的育種材料；抽取5個(gè)標(biāo)記共35個(gè)多態(tài)位點(diǎn)建立了48份抗感黃曲霉或相關(guān)花生種質(zhì)的“引物+0，l字符串”計(jì)算機(jī)化的DNA指紋圖譜。篩選出的優(yōu)異種質(zhì)可在抗黃曲霉品種培育中作親本利用，以拓寬其遺傳基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：抗黃曲霉；遺傳多樣性；聚類分析；指紋圖譜

中圖分類號(hào)：S565.202.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）01-0001-06

花生（Arachis hOpogaea L.）是重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，是眾多發(fā)展中國家主要的油脂和蛋白質(zhì)來源，但同時(shí)花生也是易受黃曲霉毒素污染的農(nóng)作物之一。黃曲霉毒素（Aflatoxin）是一種強(qiáng)致癌生物毒素，它對(duì)花生及其加工產(chǎn)品的污染已成為影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全的主要問題之一，嚴(yán)重威脅人類健康，制約全球花生產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

花生對(duì)黃曲霉毒素污染的抗性主要有兩種類型，即抗侵染和抗產(chǎn)毒。抗侵染的種質(zhì)較多，從1973年開始，先后篩選出J11、P1337394F、P1337409、GFA-l、GFA-2、AR-1、AR-2、AR-3、AR-4、ACC63、CES48-30等近40份高抗、中抗種質(zhì)，黃曲霉菌在這類花生種質(zhì)上很難侵染和定殖，這是一種基于種皮結(jié)構(gòu)及生化成分的抗性。抗產(chǎn)毒種質(zhì)相對(duì)較少，只有4份，分別為抗黃曲霉產(chǎn)毒種質(zhì)US26和低產(chǎn)毒花生品種Tifton-8、91322、91048，這類種質(zhì)在黃曲霉菌侵染后可抑制毒素產(chǎn)生，該抗性與花生的種皮及胚有關(guān)系。花生對(duì)黃曲霉菌的侵染抗性和產(chǎn)毒抗性都具有降低黃曲霉毒素污染的作用。前人研究表明，抗侵染和抗產(chǎn)毒由相對(duì)獨(dú)立的抗性基因所控制，通過分子育種聚合多個(gè)抗病基因是解決花生黃曲霉毒素污染最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。

明確抗病資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，發(fā)掘優(yōu)良抗性種質(zhì)，是培育抗病品種的基礎(chǔ)。但是，由于黃曲霉毒素污染問題的復(fù)雜性，尤其是缺乏經(jīng)濟(jì)有效的抗性鑒定方法，導(dǎo)致花生抗性育種研究進(jìn)展緩慢。因此，有必要采用新的技術(shù)對(duì)花生黃曲霉抗性進(jìn)行篩選和鑒定，增強(qiáng)抗性鑒定結(jié)果的重復(fù)性、可靠性。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為花生抗黃曲霉育種提供了有力的研究手段。Hong等（2009）鑒定到5個(gè)和花生抗黃曲霉侵染高度相關(guān)的SSR標(biāo)記，其中的標(biāo)記pPGSseq19D9能區(qū)分所有的抗感品種；進(jìn)而獲得了與包括百果重、含油量、蛋白含量、成熟莢果數(shù)、分枝數(shù)等11個(gè)表型性狀相關(guān)的特異DNA標(biāo)記；還篩選到與控制種皮顏色的基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記PM93，二者的遺傳距離為5.4cM。本研究利用多態(tài)性SSR標(biāo)記構(gòu)建抗感黃曲霉及相關(guān)種質(zhì)的指紋圖譜，鑒定抗性種質(zhì)在分子水平的遺傳特征，為花生品種改良提供豐富的抗源材料，拓寬花生抗性育種的遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用國內(nèi)外已鑒定并確認(rèn)的48份抗感黃曲霉及相關(guān)花生種質(zhì)（包括7份抗其它真菌和2份抗旱種質(zhì)，見表1）為材料，每份材料選取3粒種子，水培至三片真葉出現(xiàn)，每株取一片小葉混合后加液氮研磨，CTAB法提取基因組DNA，稀釋至30ng/μL備用。

1.2 SSR標(biāo)記檢測(cè)

利用前期已篩選的46對(duì)多態(tài)性高、條帶單一的多態(tài)性引物，分析48份抗感黃曲霉及相關(guān)花生種質(zhì)的遺傳多樣性。10μL SSR-PCR反應(yīng)體系包括1.5μL DNA，1.9μL ddH₂O，5μL2×Frements Mix，引物（10U）各0.8μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 qC預(yù)變性3 min；95qC變性45 s，55 qC退火45s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后720C延伸5min。利用C1000 TouchrrM PCR儀（美國Bio-Rad公司）進(jìn)行擴(kuò)增。6%聚丙烯酰胺凝膠（29∶1）電泳在JY-JX5垂直電泳槽（北京君意東方儀器設(shè)備有限公司）上進(jìn)行，1×TBE作電泳緩沖液，每孔加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，電壓為200V，電泳時(shí)間根據(jù)片段大小確定。電泳結(jié)束后，銀染并顯影，白熾燈背景下拍照并保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果以“0，1”方式統(tǒng)計(jì)，即在相同遷移位置上，有帶的賦值為1，無帶賦值為0，建立“0，1”數(shù)據(jù)陣。多態(tài)性信息含量（PIC）是表示微衛(wèi)星序列變異程度高低的指標(biāo)。式中，Pi、pj分別為群體中某SSR分子標(biāo)記位點(diǎn)第i、j個(gè)等位變異的頻率，n為等位變異數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的遺傳多態(tài)性

46對(duì)SSR引物在48份材料中共擴(kuò)增出237個(gè)等位變異，等位變異的范圍為2～8；等位變異數(shù)最多的SSR引物是AhITC2A02和AhlTC5D06，有8個(gè)；等位變異數(shù)最少的SSR引物是GM2165，只有2個(gè)；平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出5. 15個(gè)等位變異。PIC值為0.337～0.812，最高的是PM308，最低的是GM2165，平均PIC值為0.604（表2）。圖1、圖2為其中兩對(duì)SSR引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。

46個(gè)SSR分子標(biāo)記分布于23個(gè)不同的連鎖群上，LG13、LG14、LG19等1 1個(gè)連鎖群上分別只有1個(gè)，最多的LG6上分布有7個(gè)，其余有2～5個(gè)不等。不同連鎖群上SSR標(biāo)記等位變異數(shù)不同，最少的LG21為3個(gè)，最多的LG6為34個(gè)。不同連鎖群SSR標(biāo)記的平均多態(tài)性信息含量也不同，LG5連鎖群位點(diǎn)平均PIC最小，為0.419；LG9連鎖群位點(diǎn)平均PIC最大，為0.774（表2）。

2.2 48份抗感黃曲霉及相關(guān)花生種質(zhì)的聚類分析

根據(jù)“0，1”數(shù)據(jù)構(gòu)建48份花生種質(zhì)的遺傳距離矩陣，利用“SHAN”進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，在遺傳距離為1.05處，48份種質(zhì)被分成了8組（圖3）。其中91048為低產(chǎn)毒種質(zhì)，與其它種質(zhì)距離較遠(yuǎn)，最先被分出來，單獨(dú)成一組；AR-1、AR-2中抗黃曲霉侵染種質(zhì)為第二組；紅膜七十日早、蒲廟花生和石龍紅花生3份不抗旱種質(zhì)為第三組；抗旱種質(zhì)贛榆小站秧和萬安花生聚為第四組；低產(chǎn)毒的91322和抗黃曲霉侵染的新會(huì)小粒、ICGV94433、ICGV94434、ICGV87094、ICGV95440、ICGV94379以及ICGV92243聚為第五組；PI337409F單獨(dú)為第六組；抗黃曲霉侵染的AR-4、湛秋48和GFA-2，低產(chǎn)毒的US26、Tifton-8，抗其它真菌病害的Tiffrun-ner、CIl-2-39、C209-6-60、C724-25-22、C156-47、C76-16，抗圓柱狀黑腐病的PERRY以及感病種質(zhì)泉花10號(hào)、香鄉(xiāng)聚為第七組，在遺傳距離為0.724處可以將抗黃曲霉相關(guān)種質(zhì)AR -4、US26、Tifton-8（ A）與抗其它真菌病害的Tiffrunner等6個(gè)種質(zhì)（B）以及國內(nèi)種質(zhì)（C）各自分組，并可將PERRY（E）和GFA-2（D）分別獨(dú)立出來；高感黃曲霉污染的金花1012、白沙1016、粵油92、瑤上大麻殼、茶杵豆與抗黃曲霉侵染種質(zhì)AR-3、Celebes、CES48-30、GFA-1、J11、AH7223、UF71533-1、ICGV94435、PI337409、ICGV95435、ICGV95422、ICGV87110聚為第八組，在0.935處，可將抗感（H）種質(zhì)完全分開，在0.916處，又可以將中抗黃曲霉侵染的AR-3（F）與其他高抗種質(zhì)（G）分開。從以上分組可以看出，具有相同抗性特點(diǎn)的大部分種質(zhì)都聚為一類，表明這些種質(zhì)的遺傳背景是很相似的。

2.3 48份抗感黃曲霉及相關(guān)花生種質(zhì)的指紋圖譜構(gòu)建

從46個(gè)SSR標(biāo)記中抽取5個(gè)標(biāo)記共35個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，可以將48份花生種質(zhì)完全區(qū)分開來。這5個(gè)SSR標(biāo)記分別為：AhlTC2A02（A）、AhlTC5D06（B）、STS20（C）、GNB556（D）和S093（E）。將35個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)依次排序，把擴(kuò)增產(chǎn)物的有無分別記為“l(fā)”和“0”，則可建立48份花生種質(zhì)的計(jì)算機(jī)化的DNA指紋圖譜（表3）。

3 討論與結(jié)論

3.1 SSR標(biāo)記在評(píng)價(jià)花生遺傳多樣性中的高效性

SSR分子標(biāo)記具有高豐度、高多態(tài)性、共顯性遺傳、結(jié)果穩(wěn)定、檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，應(yīng)用多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)具有優(yōu)異基因種質(zhì)的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以為抗病蟲、抗逆以及優(yōu)質(zhì)基因的精細(xì)定位及分子標(biāo)記輔助選擇等研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)采用46對(duì)多態(tài)性SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出5.15個(gè)等位變異，平均PIC值為0.604，聚類結(jié)果與抗感黃曲霉花生種質(zhì)的來源、抗性特點(diǎn)及遺傳背景非常一致，證明SSR標(biāo)記是一種可靠的標(biāo)記類型。聚類分析將AR-3、GFA-2、PERRY、PI337409F和91048分別獨(dú)立出來，說明這5個(gè)種質(zhì)與其它種質(zhì)存在較大的遺傳差異，可作為理想的育種材料，尤其是AR-3、GFA-2和PERRY株型較直立，果仁大而飽滿，符合高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)這一當(dāng)前育種要求，可作為雜交育種的親本，拓寬花生抗黃曲霉育種的遺傳基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)的創(chuàng)新。

3.2 品種指紋圖譜

品種的指紋圖譜可以看作是該品種的“身份證”，將品種、引物名稱、分子數(shù)據(jù)等有序地整合在一起，形成每個(gè)品種唯一的識(shí)別代碼。SSR引物檢測(cè)到的位點(diǎn)相對(duì)較少，且特異性強(qiáng)，譜帶清晰，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，適用于大量品種的鑒定分析。趙新燕等利用46對(duì)SSR引物構(gòu)建了20份高油野生花生的數(shù)字分子指紋，選用了3組代碼，分別為國家統(tǒng)一編號(hào)、有效引物名稱、“0，1”字符串，通過這些DNA指紋圖譜，可以有效鑒定區(qū)分所有供試材料。劉冠明等應(yīng)用SSR標(biāo)記構(gòu)建了20個(gè)南方花生主產(chǎn)區(qū)品種的指紋圖譜，僅用4對(duì)引物即可將19個(gè)品種相互區(qū)分開。王燕龍用23對(duì)SSR標(biāo)記構(gòu)建了144個(gè)花生栽培種的指紋圖譜，所用代碼為“引物代碼+十六進(jìn)制字符串”。本試驗(yàn)從46對(duì)SSR中抽取由5對(duì)標(biāo)記所產(chǎn)生的35個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，將48個(gè)抗感黃曲霉花生種質(zhì)區(qū)分開來，建立了抗感病花生種質(zhì)的“引物+0，l字符串”的指紋圖譜，為抗感黃曲霉花生種質(zhì)資源的有效利用提供指導(dǎo)。