食品專業教學中聚合酶鏈式反應機理的教學技巧

韓穎穎 劉寶林 周國燕 李維杰

摘要：對于初學者或非生物專業學生來講，聚合酶鏈式反應（PCR）的機理和指數擴增機理比較抽象而難以理解。本文就食品專業本科生和研究生教學中如何技巧性地講授這一反應的機理進行了圖文并茂有層次的闡述，包括問題的引入、復制的原理、指數擴增的依據以及如何在食品微生物檢測中應用幾個方面。

關鍵詞：食品專業教學；聚合酶鏈式反應；教學技巧

中圖分類號：G642.4 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）13-0194-02

聚合酶鏈式反應（PCR）是種在體外快速擴增特定DNA序列的方法，又稱基因的體外擴增。PCR技術類似于DNA的天然復制過程，通過兩端的寡核苷酸引物確定其特異性。因PCR反應具有微觀抽象的特點，所以對于包括食品專業學生在內的跨專業學生或初學者來講理解起來有些難度，本文就如何技巧性地講授PCR原理和應用進行探討，以便為廣大食品專業教師提供參考。

一、從食品科學中常見的問題入手

將食品與生物學相結合的連接點是食品微生物。所以在講授中，先從食品微生物中常見問題入手，使學生有可以接受的切入點。

食品微生物研究中常遇到是微生物量的檢測問題，包括益生菌是否達標，或有害微生物是否超標。但如何對這些微生物進行定量是長久以來關注的問題，比較常用的是菌落計數方法。但此方法處理較繁瑣，且易受到操作和人為方面的影響。而PCR可以為菌落的定量提供更加精確的指標。通過這樣的引入，學生可以帶著問題去探討PCR反應的機理。

二、從DNA復制原理入手講授PCR的基本原理

在PCR基本原理講授時要從學生較易理解的角度進行問題的探討。首先為什么可以用PCR對微生物進行定量呢？首先要談的是，每種生物細胞（核）內都有一種物質叫做基因或DNA。對微生物內DNA量的鑒定，就可反應某種微生物在食品中的量。

首先從DNA結構和復制講起。DNA是雙螺旋結構（如圖1A），為便于理解PCR反應，可將DNA結構以平面結構方式展示（圖1B）。從圖1B可以看到，DNA兩條鏈通過堿基配對以氫鍵結合在一起。其中腺嘌呤（A）—胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）—胞嘧啶（C）配對。能夠配對的堿基叫做互補堿基。

在生物細胞內，為實現細胞分裂，DNA每天都在進行著復制。DNA復制的起始是通過一段短的寡核苷酸引物引導進行的，尤其是反向復制的一條新鏈，必須有多條引物來引導（由于DNA的聚合須按照5到3的方向，在拓樸異構酶等將DNA雙鏈打開后，以3到5方向為模板合成的單鏈可直接按照5‘到3‘的方向合成；另一條鏈以5‘到3‘方向的母鏈為模板，所以須按照5‘到3‘的方向合成一小段一小段的DNA，最后通過連接酶連接起來），遵循A—T、G—C互補原則，按照模板鏈的堿基順序在新的鏈上添加核苷酸合成新的DNA鏈。

正是因為體內DNA復制的發現，1971年Khorana提出，如果體外有單鏈DNA、引物、dNTP和DNA聚合酶，那么在體外也可進行DNA復制反應。此設想很容易理解，但由于引物合成在當時比較困難，沒有實驗驗證，應用需求也不明確，所以后來被人淡忘。

1983年引物合成技術已經成熟。Mullis是Cetus公司專門做DNA測序的研究人員，其正為測序時DNA模板濃度太低而發愁。在一個曲折回復的山路上行駛時，Mullis想到了體外DNA復制可擴大模版的量。

DNA復制需單鏈DNA模板，但DNA一般以雙鏈形式存在。DNA單鏈在細胞內的形成靠異構酶等來完成，而在體外可通過加熱使其變性的方法進行。Mullis的此設想被其同事以實驗完成驗證。雖然Mullis因此獲得1993年的諾貝爾化學獎，但卻給分子生物學技術帶來一次新的技術革命。

PCR就是通過特定引物與模板的結合，在引物的3端以DNA聚合酶實現引物的延長，這樣一個與模板互補的單鏈就完成了合成過程。如果在互補雙鏈DNA的特定區域兩端設計引物，兩個引物分別與兩個單鏈模板互補，那么就可實現對這個特定區域的擴增。

為什么DNA復制這么重要呢？因為DNA復制可使基因這種微觀的概念以宏觀的形式展示給世人（如圖2）。同時如Mullis所遇到的，即使是微觀的DNA測序，也需要一定的DNA模板濃度。

三、PCR指數擴增原理的講授技巧

在PCR原理講解中其指數擴增（2n）較難以理解。可通過以下單個雙鏈模板的擴增過程來展示PCR的指數擴增原理（圖3）。具體來說，第一輪擴增反應過后，把模板鏈計算在內，產物增加1倍，為21；第二輪反應之后，產物在21基礎上又增加1倍，變成最初產物的22倍。如此循環，在第n個反應完成之后，產物變成原來產物的2n。

四、PCR在食品微生物檢測中的應用講解

講授完PCR原理后，教師要將學生思路拉回到第一個問題，PCR在有害微生物和有益微生物檢測中如何應用？

首先，我們可通過PCR對食品中的有害和有益微生物進行定性。生物物種DNA序列并非完全相同，如果根據每種微生物DNA序列設計合成特定的引物，通過擴增與否可推斷檢測樣品中是否含有此微生物。如細菌的rDNA（編碼核糖體RNA的DNA）可作為對細菌進行定性的指標。

其次，我們可通過PCR對各種微生物進行定量，其實就是通過對產物量的鑒定來推斷初始模板的量。如定性實驗中所講，我們可設計特定微生物的特異的引物，將樣品中的微生物混合DNA進行擴增，特定循環數目結束后，哪種細菌特異DNA擴增產物的量多，哪種細菌的初始量就多，反之亦然。

其實PCR在定量方面，還有很多其他更加復雜的定量應用方法，如有兩份樣本，哪份量比較多，哪份量比較少。這時如何定量？在此情況下可選一個內參，即將數量比較恒定的細菌作為內參，如可疑菌為沙門氏菌時，可用普通的金黃色葡萄球菌為內參。以PCR方法將兩份樣品中的金黃色葡萄球菌的量均一后，再比較兩份樣本中沙門氏菌DNA PCR擴增產物的量。通過此方法，可對兩份樣本中沙門氏菌的量進行定量。

參考文獻：

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