巴西橡膠樹膜聯蛋白基因家族成員的鑒定和表達分析

肖小虎　隋金蕾　戚繼艷　方永軍　王闖　唐朝榮

摘 要 膜聯蛋白是一個多基因家族，在植物逆境脅迫應答和生長發育等方面起重要作用。本研究以已發表的膜聯蛋白氨基酸序列為探針，對橡膠樹和其他5種植物的轉錄組和基因組進行搜索，鑒定得到14個橡膠樹膜聯蛋白基因家族成員，命名為AnnHb1-AnnHb14?；蚪Y構分析發現，14個家族成員的內含子數目為3～6個，結構域的數目為2～4個。在進化上，橡膠樹、木薯和蓖麻共3種大戟科植物的膜聯蛋白具有較近的親緣關系。表達方面，AnnHb1在各組織中普遍表達，而AnnHb6和AnnHb7主要在膠乳中表達，AnnHb10、AnnHb8和AnnHb13分別在樹葉、樹皮和雄花中特異表達，其他成員在各組織中低豐度表達或不表達；部分家族成員的表達還與葉片發育、乙烯利刺激、真菌侵染和低溫脅迫等具有一定相關性。

關鍵詞 巴西橡膠樹；膜聯蛋白；基因家族；結構和進化；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

膜聯蛋白（Annexins）是一類Ca2+及磷脂結合型蛋白，廣泛存在于真核生物中，在進化上是相對保守的多基因家族。早期對膜聯蛋白的研究主要是針對動物，研究發現膜聯蛋白參與調節動物細胞的多種生理生化過程[1-2]。1989年Boustead等[3]首次報道在高等植物中發現了膜聯蛋白，隨后有關學者陸續從玉米、豌豆、棉花等多種植物中得到了膜聯蛋白[4-6]。2000年Hofmann等[7]利用X-射線衍射晶體學及多種生物物理學方法首次闡明了辣椒的Annexin三維結構。研究發現，植物膜聯蛋白參與植物分泌作用、胞吐作用和低溫信號轉導等多種生物學功能[4，5，8]。近年來，隨著植物基因組測序的進行，相關學者從多種植物中鑒定出膜聯蛋白基因家族成員，并對家族成員的表達進行了分析，如擬南芥、番茄、水稻等[9-11]。但是關于膜聯蛋白在橡膠樹、木薯等大戟科植物中的研究卻未見報道。本研究以已發表的膜聯蛋白氨基酸序列為探針，對橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻等6種植物的基因組數據進行全面搜索，鑒定得到65個膜聯蛋白基因家族成員，其中包括14個橡膠樹膜聯蛋白基因；并利用相關軟件和數據庫數據對這些家族成員的基因結構、進化和表達水平進行了系統分析。研究結果將有助于深入了解橡膠樹膜聯蛋白的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室Solexa測序所用的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）為熱研7-33-97，根取自中國熱帶農業科學院橡膠研究所種質資源圃華玉偉老師贈送的熱研7-33-9組培苗，其他組織（包括膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花）均取自中國熱帶農業科學院試驗場三隊的正常割膠橡膠樹（開割2年以上）；不同發育時期的橡膠樹葉片取自中國熱帶農業科學院橡膠所種質資源圃一年生的熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要取自海南省儋州市中國熱帶農業科學院試驗場三隊熱研7-33-9正常開割樹（3天一刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同時間處理橡膠樹，相應4個處理時間點為0 h、3 h 、12 h和24 h ，具體實驗步驟參照肖小虎[12]的方法進行。

網上測序數據來自NCBI SRA數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），包括不同組織（PRJNA201084）、真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance，PRJNA179126）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078）和乙烯利處理（PRJNA182079）等數據，詳細信息參見數據庫中實驗說明。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析 為了全面鑒定橡膠樹、擬南芥、楊樹、水稻、木薯和蓖麻的膜聯蛋白基因家族成員，筆者從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數據庫下載了6種植物的基因組和轉錄組數據；以已發表的膜聯蛋白序列為探針，對6種植物的基因組和轉錄組進行搜索，得到候選膜聯蛋白基因家族成員；利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對候選基因的結構域進行分析；再利用EMBOSS數據庫的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）對基因的等電點和分子量進行批量分析。

1.2.2 基因結構與進化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對橡膠樹和其他5種植物膜聯蛋白基因家族成員的外顯子/內含子組織結構進行分析。利用MEGA 6.0軟件構建橡膠樹和其他5種植物膜聯蛋白氨基酸序列的系統發育樹，采用Neighbor-Joining方法分析分子系統學，進行1 000次bootstrap統計學檢驗。

1.2.3 基因的表達模式分析 利用本實驗室和NCBI的solexa轉錄組數據對橡膠樹膜聯蛋白基因家族成員的表達模式進行分析[13]：首先，將NCBI的SRA數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中橡膠樹相關的solexa轉錄組數據下載到本地服務器，去除低質量序列，利用程序RSEM進行表達分析[14]。

2 結果與分析

2.1 膜聯蛋白基因家族成員的鑒定與序列分析

本研究利用tblastn搜索各植物轉錄組和基因組數據，共鑒定得到了65個膜聯蛋白（表1），其中橡膠樹14個，命名為AnnHb1～AnnHb14。通過序列分析發現，橡膠樹膜聯蛋白含234～342個氨基酸，分子量為27～39 ku，等電點在6.3～9.6，內含子數目為3～6個。氨基酸多序列比對發現，橡膠樹膜聯蛋白含有多個保守結構域（圖1）。

2.2 基因結構和進化分析

對橡膠樹和其他5種植物annexin基因的外顯子/內含子的組織結構以及進化關系進行了分析（圖2）。結果發現，同一進化分支上的家族成員在內含子數目和相對位置上以及結構域的相對位置上具有一定的相似性，如AnnMe9、AnnHb5、AnnRc7、AnnHb1、AnnMe6和AnnPt3聚在同一個分支，都含有5個內含子，其內含子和結構域的相對位置都非常一致； 也有一些分支存在較大差異，如AnnOs1和AnnOs6聚在同一個分支，其中AnnOs1僅有2個內含子，而AnnOs6含有5個內含子。在進化上，橡膠樹annexin基因主要和木薯、蓖麻annexin基因聚在一起，這與此3種大戟科植物具有較近的親緣關系的結論一致。

2.3 橡膠樹膜聯蛋白基因家族成員的表達分析

本實驗室Solexa轉錄組測序數據分析結果表明，AnnHb1在所檢測的組織中都普遍表達，在葉片發育過程中呈下調表達，而在乙烯利處理后的不同時間點呈上調表達；AnnHb10主要在葉片中表達，并且在葉片穩定期的表達要高于其他時期；AnnHb6和AnnHb7主要在膠乳中高豐度表達，并且AnnHb7在乙烯利處理后有一定的下調表達趨勢；AnnHb8和AnnHb13分別在樹皮和雄花中表達；其他家族成員，如AnnHb2、AnnHb3、AnnHb4、AnnHb9、AnnHb11、AnnHb12和AnnHb14在各組織中的表達豐度都很低或不表達（圖3）。

轉錄組數據分析結果（圖4）表明，AnnHb1在所分析的各組織中普遍表達，這和本實驗室轉錄組數據的分析結果一致，在真菌C. cassiicola侵染的葉片中AnnHb1上調表達。AnnHb8、AnnHb10、AnnHb6和AnnHb7分別在樹皮、樹葉和膠乳中高豐度表達，其中AnnHb10在C. cassiicola侵染后下調表達，AnnHb7在乙烯利處理后下調表達。另外，AnnHb2在低溫脅迫下呈下調表達，其它基因在所檢測樣品中低豐度表達或不表達。

從以上2部分實驗數據的結果來看，橡膠樹膜聯蛋白基因家族成員的表達分為3種類型：第一種類型為普遍表達，如AnnHb1在各組織中均有表達，并且表達豐度也較高；第二種類型為組織特異性表達，如AnnHb8、AnnHb10、AnnHb6和AnnHb7分別在樹皮、樹葉和膠乳中特異表達；第三種類型為低豐度表達或不表達，如AnnHb4、AnnHb9、AnnHb11、AnnHb12等。從分析結果可以看出，橡膠樹膜聯蛋白的表達與橡膠樹的生長發育以及逆境脅迫應答都有一定的相關性。另外，通過對2部分實驗的結果進行比較可以看出，2部分實驗結果非常一致，這也說明本研究結果的準確性。

3 討論與結論

早期對膜聯蛋白的研究主要集中于動物細胞，研究發現膜聯蛋白對動物的分泌過程有一定的調節作用[1]。因而對植物膜聯蛋白的研究早期也集中在分泌型細胞，隨著功能研究的進行，結果發現膜聯蛋白在植物生長發育調控和環境適應方面扮演重要角色。在擬南芥中，膜聯蛋白基因家族成員有8個（AnnAt1～AnnAt8），研究發現這些成員在多種脅迫處理下表現出不同的表達模式，大部分基因受鹽、干旱、脫落酸（ABA）以及高低溫脅迫的誘導[15]。Breton等[16]在耐寒型小麥中發現2種可響應低溫脅迫且不依賴于Ca2+的膜聯蛋白基因。白楊葉片受低溫脅迫可誘導膜聯蛋白基因的上調表達[16-17]。利用本實驗室和NCBI已有Solexa數據，筆者對14個橡膠樹膜聯蛋白的表達進行了分析，發現AnnHb1在各組織中普遍表達，推測該基因在進化上功能相對比較保守；AnnHb8、AnnHb10、AnnHb6和AnnHb7呈組織特異性表達，推測這些基因在進化過程中發生變異，在特異組織發揮功能。AnnHb7在乙烯利處理后下調表達，AnnHb1在真菌C. Cassiicola侵染的葉片中上調表達，而AnnHb10在C. Cassiicola侵染后下調表達，AnnHb2在低溫脅迫下呈下調表達。從分析結果可以看出，橡膠樹膜聯蛋白的表達與橡膠樹的生長發育以及逆境脅迫應答都有一定的相關性，這與已有研究中所述膜聯蛋白的功能一致。本研究首次利用Solexa高通量數據對橡膠樹膜聯蛋白基因家族的表達進行分析，本實驗室和NCBI數據的一致性證明了本研究結果的準確性。另外，本實驗室的高通量數據已成功應用于橡膠樹基因組數據分析以及橡膠樹蔗糖合成酶基因家族相關分析，相關結果發表在Nature Plants[18]和 Febs Journal[13]，這進一步證實了本研究數據結果的可靠性。隨著高通量測序技術的不斷發展，網上可利用的高通量數據越來越豐富，利用這些數據對全基因家族成員進行系統的分析，將為后續基因功能研究打下基礎。本研究首次鑒定了14個橡膠樹膜聯蛋白基因家族成員，并對其基因結構、系統進化和表達模式進行了系統的分析，研究結果將有助于深入了解膜聯蛋白在橡膠樹生長發育和逆境脅迫應答過程中所起的作用，為后續研究打下基礎。

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