雨生紅球藻中蝦青素的檢驗及應用的研究進展

肖麗恒

DOI：10.16660/j.cnki.1674-098X.2016.18.063

摘 要：目的 薄層層析法和高效液相法兩種分離方法在雨生紅球藻中提取所得到的總類胡蘿卜素來進行檢測。方法 通過TLC法檢測蝦青素成分，通過HPLC法C18柱對蝦青素中的各組分進行了準確分析和鑒定。結果 TLC檢測蝦青素成分發現，由于正己烷與丙酮的比例不同，會對細胞內的胡蘿卜素薄層層析效果產生很大影響；展開時間10 min后，在蝦青素的粗體物質中，其分離效果最佳，時間在10 min后繼續延續就會出現拖尾現象。HPLC檢測蝦青素濃度曲線實驗中，設計方程式精確快捷地測出了各種游離蝦青素的濃度，當這個系數在0.99以上時，證明它們有良好的聯系。結論 對蝦青素TLC的展開效果影響較大的一個因素就是正己烷與丙酮不同比例配比；對展開時間影響蝦青素薄層層析效果的探究中得知：當展開時間是10 min時，各成分的分離效果最佳。該文研究所得的結果及數據與文獻中的報道大致一樣。

關鍵詞：雨生紅球藻 蝦青素 檢驗 色譜法

中圖分類號：TS254.5 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2016）06（c）-0063-02

薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC），又叫作薄層層析，屬于固-液吸附色譜的一種，經常被用來做類胡蘿卜素的分離純化。這種方法就是在涂有硅膠薄層的玻璃板上點樣品，再通過正己烷和丙酮的混合溶劑展開分離之后，可以看出：在硅膠薄層上，從雨生紅球藻中提取的類胡蘿卜素樣品呈帶狀分布。當硅膠板上的類胡蘿卜素進行有效分離時，因不同類的胡蘿卜素其末端基因的差異，從而導致產生不同的色譜行為，隨著不同速率的展開劑的應用差別，從而分離開不同的組分。

高效液相色譜法（HPLC）能對蝦青素中的各組分含量予以高效、精準的分析，其分析的原理就是根據樣品中不同組分，在固定相和流動相間的重復多次平衡分配，通過分配中產生的微小差別來達到分離的目的。可以利用時間來表示樣品中的各組分在色譜柱內的滯留能力，這屬于色譜定性的根本依據。色譜柱是整個系統中的核心組成部分，在其中進行HPLC的分離過程，文章通過C18柱對蝦青素中的各組分進行了準確分析和鑒定。

1 實驗材料

根據實現和查閱相關資料及文獻可以發現，在提取蝦青素時，用丙酮作為提取溶劑，對蝦青素酯的皂化效果會有一定的影響。而且在通過HPLC進行分析時，還會有倒峰出現，所以，在文中，提取蝦青素所用的溶劑是乙酸乙酯與乙醇（v/v，2/1）的混合溶劑。

1.1 實驗試劑與材料

1.1.1 試劑

實驗中用到的主要試劑有：德國Dr.Ehrenstorfer公司生產的純度95.2%的蝦青素標準品、上海埃彼化學試劑生產的正己烷（AR）、無水乙醇（AR）、三氯甲烷（AR）以及國藥集團生產的甲醇（色譜純）試劑。

1.1.2 材料

文章中用到的主要材料有青島長揚化工公司生產的規格為20 mm×75 mm的CF254硅膠板以及規格為0.5 mm的玻璃毛細管點樣管。

1.2 實驗儀器

此文試驗應用到的主要儀器設備由上海滬西儀器公司及上海華美公司提供。主要儀器有層析缸、RE-52AA旋轉蒸發儀、循環水式多用真空泵、恒流泵以及高效1260型液相色譜儀等。

1.3 實驗方法

TLC法檢測蝦青素成分，具體如下。

（1）硅膠板的活化。

硅膠吸附劑的顆粒外表面或它的多孔結構里，孔的外表面既能夠吸附物質，也可以可逆地吸附水分，但如果吸附了水分，它對其他物質的吸附能力就隨之有所降低，所以，吸附劑吸附能力的高低取決于它吸附了多少水分。活化指的就是硅膠在一定溫度下烘烤，把吸附的水分除去。基于文獻，選擇在溫度為100 ℃下活化1 h。

（2）最佳展開劑的確定。

把正己烷與丙酮的混合液作為TLC的展開劑，并對這兩者因配比不同影響TCL效果進行研究，最終選擇最好的展開劑。把正己烷與丙酮之間的體積比分別設定為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4，再通過不同的展開效果來確定最好的展開劑。

（3）薄層層析操作方法。

把標準品（作為對照）和需要分析的各樣品分別點在經過活化的硅膠板上，將所有點定在同一個位置上，并記至硅膠板的表面時，將硅膠板取出，記錄下展開劑液面和樣品中的各個組分在硅膠板上的位置，再測出原點與斑點和展開劑前沿之間的距離，用高扭矩以下的公式來計算Rf值。

2 結果與分析

2.1 TLC檢測成分

對硅膠板進行活化，由于正己烷與丙酮的比例不同，這就會對細胞內的胡蘿卜素薄層層析效果產生很大影響，當兩者的體積比是7∶3的時候，此時分離的蝦青素顯現出的效果是最佳的，此時，Rf的標準值是0.22，且樣品中的每種成分的Rf值都不相同，這樣就能夠較好地把其中4種不同的成分分離開。再把樣品通過與硅膠板位置進行比較，可知，游離蝦青素和標準樣品在同一條直線上的顏色最淡，再通過蝦青素中不同成分的不同含量和各個位置顏色的濃淡程度，就可以得出，游離蝦青素點上，顏色最濃的點就是蝦青素單酯，其次，顏色較淡的點就是蝦青素雙酯，因沒有對照品，最上面的成分暫時不能確定。在裝有展開劑的密閉層析缸中放入經過點樣處理過后的硅膠板，因色素不同，樣品點上出現的色素帶就不同，當展開時間不在一定范圍內的時候，就會出現一種叫拖尾的現象，在這個實驗所使用的展開劑和條件下，展開時間10 min后，在蝦青素的粗體物質中，其分離效果最佳，時間在10 min后繼續延續就會出現拖尾現象。

2.2 HPLC檢測成分

為了使得對游離蝦青素濃度的檢測方便快捷，以下做了一個關于游離蝦青素濃度和HPLC峰面積圖表來建立起了它們之間的一個方程式，這樣就可以精確、快捷地測出各種游離蝦青素的濃度，如圖1的實驗結果。當游離蝦青素的濃度范圍是0～15 mg/L時，它們基本保持呈直線的趨勢，其方程式是：8983.2+239923x=y，在這當中，x表示游離蝦青素的濃度（mg/L），y表示HPLC的峰面積；與之相關聯的系數R2為0.9988。當這個系數在0.99以上時，證明它們有良好的聯系，這個方程可以使用來定量分析游離蝦青素的濃度。

通過游離蝦青素的實驗條件下，可以保留大概5.5 min，在提取品中發現的游離蝦青素含量較少，這是由于提取品中的蝦青素波峰很小。隨著提取的進程，后面出現了比較明顯的波峰，通過分析其結果，說明這兩個較大的波峰是蝦青素單酯與蝦青素雙酯。

通過計算蝦青素提取品中各種物質的峰面積，就可以得出，游離蝦青素占所提取的總類胡蘿卜素的5.6%，蝦青素單酯占67.5%，蝦青素雙酯占12.6%，其他成分為14.8%，這與文獻中的報道數據大致是相同的。

3 蝦青素的分離純化及應用

在雨生紅球藻中，蝦青素大多是以酯的形式存在，不過由于在蝦青素酯的組成中，其脂肪酸有很多種類，它們的構成也非常復雜多樣，幾乎沒有任何對照品，加上其他類胡蘿卜素的干預，導致很難對蝦青素的分離純化以及定量定性分析。所以，在此實驗中，通過皂化法把不相同的蝦青素酯變為游離蝦青素，通過HPLC，就能精準測量出蝦青素的含量了。此章節主要改進一些對皂化產生影響的條件，已達到在不影響蝦青素本身性質的前提下來迅速有效地對蝦青素酯進行皂化的目的。

經過皂化處理之后的蝦青素粗提取品，主要就是游離蝦青素。但依然會有其他少量色素存在，這些少量色素的來源大概是：其中一部分來源可能是游離蝦青素的降解，另一部分可能來于原料中少量的其他類別的胡蘿卜素（比如β-胡蘿卜素、葉黃素以及其他色素等）。若還要對游離的蝦青素和其他成分做進一步分離，就要對樣品進行柱層析分離等步驟。柱層析的建立是基于在混合物中，不同組分在其物理性質和化學性質的不同點上的，這些性質的不同使其分離時間產生差異，這樣就達到了分離的目的。這種方法操作比較簡捷，分離純度也很高，不需要很貴的一些器材，所以，這種方法在蝦青素的分離中得到了廣大應用。它不同于紙層析、薄層層析的特點就是它可以在工業生產的大規模分離中使用。

4 結語

文章重點通過薄層層析法和高效液相法兩種分離方法，對雨生紅球藻中提取所得到的總類胡蘿卜素來進行檢測，得出以下結論。

（1）蝦青素TLC的展開效果影響較大的一個因素就是正己烷與丙酮不同比例配比，正己烷與丙酮之間的最佳配比（體積比）是7∶3。把正己烷：丙酮（v∶v，7∶3）的混合溶劑作為展開劑的時候，游離蝦青素的Rf值是0.21，而且，各個樣品中各種成分的Rf值是顯然有較大差異的，這樣就能夠使得各種組分可以有效地分離開。

（2）在對展開時間影響蝦青素薄層層析效果的探究中得知：當展開時間是10 min的時候，每一種成分的分離效果是最佳的。

（3）用薄層層析法對雨生紅球藻中提取的總類胡蘿卜素進行檢測得知：蝦青素單酯和雙酯是總類胡蘿卜素的主要成分，含有少量蝦青素和其他成分。

通過HPLC對蝦青素粗提取品的檢測結果得知：游離蝦青素在總類胡蘿卜素的5.6%，蝦青素單酯占67.3%，蝦青素雙酯占12.5%，其他成分為14.6%，與文獻中的報道大致一樣。

參考文獻

[1] 李小慧，鄒寧，孫東紅，等.雨生紅球藻中蝦青素的提取工藝優化[J].安徽農業科學，2015（15）：23-24.

[2] 王紅霞，楊雯，田洪，等.雨生紅球藻中蝦青素的提取及穩定性研究[J].中國食品添加劑，2015（2）：101-106.