醌氧化還原酶抑制劑對乳腺癌細(xì)胞抑制作用的研究

田宇佳 朱坤 龐春慧 陳麗艷

摘 要：乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一。研究表明，乳腺癌的增殖及耐藥是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，明確乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找有效的治療靶點是延長乳腺癌患者生存時間的關(guān)鍵。最近研究表明，醌氧化還原酶在多種腫瘤中表達(dá)異常增高，并與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過在乳腺癌細(xì)胞株T47D中給予醌氧化還原酶抑制劑β-拉帕醌，觀察其對乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響，并探討可能的分子機制。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；細(xì)胞；蛋白

1 材料

1.1 試劑和儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、胰蛋白酶購自Hyclone公司，MTT購自Sigma公司，β-拉帕醌購自Selleck公司；Bcl-2、Bax一抗購自Cell Signaling公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

T47D細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長至70%～80%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 實驗分組

對照組；β-拉帕醌高（8umol/L）、中（4umol/L）、低（2umol/L）劑量組。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖抑制實驗

取對數(shù)增殖期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁后給藥，分別培養(yǎng)24、48、72 h。加入預(yù)先配制的MTT液50uL，37℃繼續(xù)孵育4 h。加入150uL DMSO后，在波長490 nm處測定各孔光吸收值（A），按下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率：

細(xì)胞增殖抑制率（%）

=[1-（A給藥組-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）]×100

2.2 蛋白印跡法檢測凋亡蛋白的表達(dá)

提取各組細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)并5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4℃反應(yīng)過夜；二抗室溫反應(yīng)60 min；ECL增強發(fā)光。以actin蛋白作內(nèi)參照，圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT檢測結(jié)果顯示， β-拉帕醌分別作用T47D細(xì)胞24、48和72h后，細(xì)胞增殖速度下降明顯，結(jié)果見表1。

3.2 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

蛋白印跡檢測結(jié)果顯示， 用藥組細(xì)胞bcl-2表達(dá)明顯下降，而bax蛋白表達(dá)明顯增加，用藥組bcl-2/bax比值明顯降低，見圖2。

4 討論

凋亡普遍存在于大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有密切的關(guān)系。因此，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的一個新熱點。本實驗中MTT結(jié)果顯示β-拉帕醌對乳腺癌細(xì)胞T47D的增殖具有明顯的抑制作用，并具有量效關(guān)系。

凋亡的過程受到多基因調(diào)控。Bcl-2和Bax是一對凋亡相關(guān)調(diào)控基因，Bcl-2主要通過與其家族成員Bax形成二聚體而發(fā)揮作用，當(dāng)Bcl-2表達(dá)量較高時，Bcl-2和Bax形成異源二聚體而抑制凋亡；當(dāng)Bax表達(dá)較高時，bax之間形成同源二聚體而促進(jìn)凋亡。在本實驗中，用藥組Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯減弱，Bax蛋白表達(dá)明顯增強，Bcl-2/Bax比值明顯降低，說明β-拉帕醌可有效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，這可能是抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機制之一。

參考文獻(xiàn)：

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基金項目：延邊大學(xué)本科生創(chuàng)新課題（2015）

通訊作者：陳麗艷