雙價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻的育成及初步鑒定

崔彥芹 李尚偉 張麗萍 羅洪發(fā) 李云峰 查仁明

摘要：【目的】構(gòu)建雙價(jià)抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，為選育廣譜、高抗轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻提供技術(shù)參考。【方法】構(gòu)建半夏凝集素基因（pta）和蘇云金桿芽孢菌基因（Bt）兩個(gè)抗蟲(chóng)基因的雙價(jià)表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta，利用大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系輻恢838，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS染色及PCR鑒定。【結(jié)果】以構(gòu)建的雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta為模板，PCR擴(kuò)增到pta基因的部分片段，大小為807 bp，且該載體經(jīng)Hind Ⅲ酶切后，能得到15854 bp的中間載體pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS染色，得到3株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，經(jīng)PCR鑒定結(jié)果顯示外源基因已成功導(dǎo)入水稻。【結(jié)論】通過(guò)構(gòu)建雙價(jià)抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，成功獲得的轉(zhuǎn)基因植株可用于水稻抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系及組合的研究，以提高其抗病蟲(chóng)害能力。

關(guān)鍵詞： Bt基因；pta基因；載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因水稻；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S511.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）02-0169-05

0 引言

【研究意義】水稻是最重要的糧食作物之一，世界上半數(shù)以上的人口以水稻為主食。蟲(chóng)害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因，據(jù)報(bào)道，田間水稻害蟲(chóng)種類(lèi)在624種以上，每年因螟蟲(chóng)造成的產(chǎn)量損失達(dá)1.0×1010 t，對(duì)其品質(zhì)也造成嚴(yán)重威脅（劉立軍等，2009；朱禎，2010；張嵐等，2011），因此選育抗蟲(chóng)水稻品種尤為重要，但僅靠常規(guī)育種難以解決抗蟲(chóng)育種資源稀缺的問(wèn)題，須通過(guò)研究轉(zhuǎn)基因水稻來(lái)完成。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）基因的表達(dá)產(chǎn)物為Bt毒蛋白，是一種殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP），其殺蟲(chóng)效果安全、高效，對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲(chóng)具有高度特異性（孟志剛，2012）。半夏凝集素（Pinellia ternate agglutinin，pta）對(duì)同翅目害蟲(chóng)如稻飛虱、葉蟬等有顯著抗蟲(chóng)作用，故pta基因常作為外源基因應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物研究（趙歡和彭正松，2014）。在抗蟲(chóng)育種時(shí)，若能將兩個(gè)基因同時(shí)導(dǎo)入作物中，便可避免抗性基因的單一性和脆弱性，維持作物抗蟲(chóng)的持久性。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，隨著植物基因工程的快速發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)胫参铮蛊渥陨頂y帶抗蟲(chóng)能力以達(dá)到抗蟲(chóng)目的（韓蘭芝等，2006）。熊恒碩等（2008）將含有CryIA（a）/CryIA（c）、pta和Bar基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體p3300-Bt-pta轉(zhuǎn)化苜蓿子葉，成功獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。田強(qiáng)強(qiáng)等（2011）構(gòu)建的雙價(jià)抗病蟲(chóng)基因植物表達(dá)載體Lc-ChiA-pBI121可用于植物轉(zhuǎn)基因研究，提高植物抗病蟲(chóng)害能力。Xiao等（2012）將pta和Cry1Ac基因同時(shí)導(dǎo)入大青，發(fā)現(xiàn)其協(xié)同作用可使植株對(duì)飛蛾和蚜蟲(chóng)的抗性增強(qiáng)。張學(xué)明等（2015）用植物表達(dá)載體pC1301-LoxRi和pCAMBIA3301-KTi-SBA，構(gòu)建雙價(jià)表達(dá)載體pCAMBIA3301-SBA-Lox并轉(zhuǎn)化大豆，獲得轉(zhuǎn)基因大豆。【本研究切入點(diǎn)】鱗翅目和同翅目是危害水稻較嚴(yán)重的昆蟲(chóng)種類(lèi)，Bt和pta基因分別對(duì)這兩類(lèi)昆蟲(chóng)有顯著抗蟲(chóng)作用，但目前尚無(wú)將Bt和pta基因同時(shí)導(dǎo)入水稻而獲得廣譜性抗蟲(chóng)水稻的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】構(gòu)建雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta，轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系輻恢838，以期獲得廣譜性抗蟲(chóng)水稻，為獲得高抗、廣譜抗蟲(chóng)水稻材料提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

受體材料為水稻優(yōu)良恢復(fù)系輻恢838，由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌LBA4404由西南大學(xué)水稻研究所提供。雙酶切載體pCAMBIA1301和質(zhì)粒pUC57-Bt和pCU57-pta由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。BamH I、Spe I等限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、GUS染液、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒及其他重要試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：瓊脂糖電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）、UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）、微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 表達(dá)載體構(gòu)建 用BamH I和Spe I雙酶切載體pCAMBIA1301和質(zhì)粒pUC57-Bt，再用T4 DNA連接酶將兩者連接可獲得中間載體pCAMBIA1301-Bt，最后用Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒pCU57-pta和中間載體，并連接構(gòu)建雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta。

1. 2. 2 載體轉(zhuǎn)化及鑒定 用熱激法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)抗生素篩選、PCR鑒定（引物見(jiàn)表1，反應(yīng)體系見(jiàn)表2，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆茫ind Ⅲ酶切鑒定和測(cè)序，獲得陽(yáng)性克隆子。再用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，用凍融法將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行PCR和酶切鑒定，操作方法與大腸桿菌同（Sambrook and David，2002）。

1. 2. 3 含Bt-pta基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻 將含Bt-pta的根癌農(nóng)桿菌LBA4404送至武漢泊遠(yuǎn)生物科技有限公司，經(jīng)水稻成熟胚預(yù)處理、農(nóng)桿菌侵染、篩選Ⅰ、篩選Ⅱ、分化、生根及分子檢測(cè)等，以獲得Bt-pta雙價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻。

1. 2. 4 GUS組織化學(xué)染色 將轉(zhuǎn)基因水稻植株的嫩葉剪切后放于0.2 mL PCR管中，加入適量GUS染液，37 ℃下染色3～20 h，至藍(lán)色清晰可見(jiàn)。

1. 2. 5 PCR檢測(cè) 根據(jù)pta、GUS及Bt基因序列設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR反應(yīng)體系（25.00 μL）：DNA模板 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 0.50 μL，引物F1和R1各1.50 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，加滅菌水至25.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 30 s，59～60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta如圖1所示。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，經(jīng)含抗生素培養(yǎng)基篩選，挑取大腸桿菌菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約807 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，可初步鑒定為陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性大腸桿菌質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ酶切后（圖3），得到15854 bp的中間載體pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段（已插入酶切位點(diǎn)），表明目的基因pta已連接至中間載體pCAMBIA1301-Bt上，成功構(gòu)建雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta。

2. 2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定結(jié)果

轉(zhuǎn)化再生水稻植株經(jīng)馴化、移栽后，共獲得15株轉(zhuǎn)化植株，取其幼嫩葉片剪碎后進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖4所示，其中3株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。對(duì)3株陽(yáng)性植株的pta、Bt及GUS基因分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5和圖6所示。Bt基因檢測(cè)結(jié)果表明，除陰性對(duì)照未擴(kuò)增出目的片段外，陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性質(zhì)粒）及GUS染色呈陽(yáng)性的3株轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果（396 bp）相符；pta基因檢測(cè)結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性質(zhì)粒）及GUS染色呈陽(yáng)性的3株轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果（314 bp）相符；GUS基因檢測(cè)結(jié)果表明，除陰性對(duì)照未擴(kuò)增出目的片段外，陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性質(zhì)粒）及GUS染色呈陽(yáng)性的3株轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果（350 bp）相符。

3 討論

目前單價(jià)轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸成熟，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作育種的研究領(lǐng)域。Datta等（1998）將Cry1Ab基因?qū)敫鞣N秈稻和粳稻中，獲得一系列對(duì)三化螟幼蟲(chóng)具有高致死率的轉(zhuǎn)Bt基因水稻；張紅宇等（2003）首次成功將從半夏花序中克隆的半夏凝集素基因?qū)?個(gè)水稻品種，為pta基因在水稻抗蟲(chóng)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；戴軍等（2014）將Bt cry1Ah基因?qū)胗衩鬃越幌稻C31中，獲得1株對(duì)玉米螟有顯著抗性的轉(zhuǎn)基因植株。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)育種研究的深入，存在的問(wèn)題日益凸顯，如轉(zhuǎn)單價(jià)抗蟲(chóng)基因植株抗蟲(chóng)譜單一，害蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性等。因此，近年國(guó)內(nèi)外的轉(zhuǎn)基因研究呈現(xiàn)由單一基因向多基因發(fā)展的趨勢(shì)（余桂容等，2015）。隨著技術(shù)的不斷成熟，可成功構(gòu)建雙價(jià)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化小麥、煙草等作物中，培育出多種雙價(jià)轉(zhuǎn)基因植株，如范媛媛等（2004）構(gòu)建了植物表達(dá)載體p3300-Bt-pta并轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)煙草；Yu和Wei（2008）將Bt和pta基因轉(zhuǎn)化小麥，并獲得雙價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因小麥。

本研究通過(guò)構(gòu)建雙價(jià)抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta并轉(zhuǎn)化水稻，由于該植物表達(dá)載體是以GUS基因?yàn)閳?bào)告基因，可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)快速篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。但在將轉(zhuǎn)基因水稻從人工氣候箱移栽到海南三亞大田過(guò)程中，由于環(huán)境變化和長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸導(dǎo)致大量禾苗死亡，只得到3株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，由于其數(shù)量較少，為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，未對(duì)其進(jìn)行農(nóng)藝形狀分析。此外，本研究?jī)H對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步的篩選和鑒定，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，基因在后代會(huì)產(chǎn)生分離，為得到純合和穩(wěn)定遺傳的植株，需進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的后代進(jìn)行分子檢測(cè)如Southern blotting、Western blotting等及連續(xù)多代自交篩選和鑒定，將出現(xiàn)性狀分離的植株淘汰，篩選出高代純合轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因后代純系進(jìn)行株高、產(chǎn)量及相關(guān)性狀考察及抗蟲(chóng)性鑒定。

4 結(jié)論

本研究篩選出3株Bt-pta雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻，可用于水稻抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系及組合的研究，以提高其抗病蟲(chóng)害能力。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）