熒光衰退時間間隔對抗氧化物質(zhì)ORAC值的影響分析

許勝 黃慧明 屈達才 卓秋虹 趙紅平

摘 要 目的：實驗定量探討熒光衰退時間間隔的選取對抗氧化物質(zhì)ORAC值的影響。方法：以維生素C和實驗室自提的桑葚花色苷提取物為樣品，Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物，選取設(shè)置不同的熒光衰退時間間隔，應(yīng)用ORAC法測定樣品與標(biāo)準(zhǔn)物的熒光衰退曲線，計算樣品ORAC值，分析不同熒光衰退時間間隔對樣品AUC、Net AUC和ORAC值的影響。結(jié)果：熒光衰退時間間隔對于維生素C和桑葚花色苷提取物ORAC值的影響均在2%以內(nèi)，定量地表明了熒光衰退間隔時間對于論文中樣品ORAC值影響較小。結(jié)論：（1）研究結(jié)論為ORAC法中選取熒光衰退間隔時間提供參考，建議可在為1～5 min范圍內(nèi)隨機選取；（2）基于手動記錄讀數(shù)的熒光酶標(biāo)儀，研究結(jié)論建議可選取較長的熒光衰退間隔時間，如5 min，以有利于手動記錄，也有利于與某些檢測時間較短的試樣交叉進行。

關(guān)鍵詞 氧自由基清除能力；熒光衰退；間隔時間；維生素C；桑葚花色苷提取物

中圖分類號：R-331；S888.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）09-00-05

氧自由基清除能力法（Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC）用于檢測樣品的總抗氧化能力，因其具有自動化且標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，已然成為體外抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法之一，例如國 眾多生產(chǎn)商已經(jīng)將通過ORAC法測得的物質(zhì)ORAC值寫在了商標(biāo)上以表明其產(chǎn)品的抗氧化能力。在ORAC法檢測中，基于熒光酶標(biāo)儀檢測不同時間間隔△t的抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox、被檢測樣品以及熒光素等的熒光衰退強度，并通過計算熒光衰退的凈面積計算被檢測樣品抗氧化能力的ORAC值。作為潛在的抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，諸多文獻對其ORAC檢測數(shù)值的影響因素做了深入探討，如鹽離子濃度，pH值與溫度等。

進一步的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，不同的研究人員在檢測過程中選取的熒光衰退時間間隔△t是不一樣的，從1 min到5 min不等。例如Usami等測定甘藍ORAC值時△t選為1 min。張紅城[1]等測定蜂膠多酚ORAC值時△t選為1 min。湯杰[2]等測定桉葉提取物ORAC值時△t選為1.5 min。曹亞蘭[3]測定大豆肽ORAC值時△t選為2 min。Tai[4]等測定抗壞血酸原的ORAC值時采用的△t亦為2 min。何秋彤[5]等測定20種市售涼茶ORAC值時△t選為2.5 min，張水平[6]測定胡椒葉ORAC值時△t選為3 min，Wan[7]等測定大鼠血清ORAC值時△t選為4.5 min，林利美[8]等測定草魚肽ORAC值時△t選為4.5 min，李富華[9]等測定苦蕎麥皮黃酮ORAC值時△t選為4.5 min，Di[10]等測定牛酪蛋白水解物ORAC值與王立峰[11]等測定薏米酚類提取物ORAC值時的△t選為5 min。盡管對于某一物質(zhì)，其熒光衰減曲線是一定的，但是選取不同的熒光衰退時間間隔決定了熒光強度衰退曲線的光滑度，也決定了ORAC值計算時所需的曲線下的面積，相當(dāng)于光滑曲線變?yōu)殡x散折線。一方面，熒光衰退時間間隔對于ORAC值是否沒有影響，實驗者是否可以任意選取，尚未有文獻定量討論；且在實際的檢測中，包括筆者在內(nèi)的不少研究人員都曾困惑如何選取合適的熒光衰退時間間隔；另一方面，有的熒光酶標(biāo)儀是手動記錄讀數(shù)，如若熒光衰退間隔時間較短，會給人工記錄帶來不便，因此需要用較長的熒光衰退間隔時間，且如若取較長的熒光衰退間隔時間，還可在實際檢測中對于不同的樣品進行交叉檢測，因有的樣品通過酶標(biāo)儀獲取OD值時僅需要很短時間。基于此，以維生素C（Vc）和實驗室提取的桑葚花色苷提取物（Mulberry Fruit Anthocyanin Extraction，MFAE）為研究對象，在檢測中選取了不同的熒光衰退時間間隔，實驗定量探討熒光衰退時間間隔對于Vc和MFAE的ORAC值的影響，為ORAC法中選取熒光衰退間隔時間提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

維生素C（Vc）購自西隴化工股份有限公司，桑椹花色苷提取物來自實驗室提取。

1.1.2 主要儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀（EnVision，美國PerkinElmer）、移液槍（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。熒光素鈉（FL）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）均購自上海晶純生化科技股份有限公司，抗氧化物標(biāo)準(zhǔn)物Trolox購自阿拉丁生化科技股份有限公司，磷酸氫二鉀與磷酸二氫鈉購自北京化工廠；以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 ORAC實驗方法

ORAC測定參照Tai[4]等的方法，并作一定修改。將測定溫度設(shè)置為37℃，在96孔熒光板各微孔加入20 μL不同濃度（1， 2， 4， 6， 8， 10 μmol/L）抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物Trolox溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；加入20 μL的1 mg/mL MFAE與20 μL的1 mg/mL Vc溶液（因本文討論間隔時間選取的影響，故固定樣液濃度）。隨后加入20 μL的75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），接著加入20 μL濃度為70 nmol/L熒光素（FL），待儀器測定溫度升至37℃后，將已加入體系溶液的96孔板放入儀器內(nèi)，孵育15 min。啟動反應(yīng)前將熒光衰退測定間隔時間分別設(shè)為1， 2， 3， 4， 5 min，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為520 nm，隨后用八道移液槍快速加入12 mmol/L AAPH 140 μL，立即啟動測定；待各孔熒光衰退呈基線后停止測定。

1.2.2 統(tǒng)計分析

每個樣品均設(shè)置4個重復(fù)孔，實驗結(jié)果取平均值；ORAC值的計算方法參照Tai[4]。采用Origin 9.0軟件作圖分析。

2 結(jié)果分析

2.1 AAPH誘導(dǎo)不同濃度的Trolox與樣品熒光衰退曲線

加入AAPH后立即對體系溶液的熒光強度進行測定，熒光強度衰退測定間隔時間分別設(shè)為1， 2， 3， 4， 5 min。圖1給出了熒光強度衰退測定間隔時間為1 min的熒光衰退曲線，熒光強度衰退測定間隔時間為2， 3， 4， 5 min的衰退曲線與圖1類似。由圖1可知，熒光曲線衰退速率隨著抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox濃度的增大而減緩；未加抗氧化物質(zhì)的溶液體系，其熒光衰退曲線相對來說較快，約125 min達到了基線狀態(tài)；202 min后，最高濃度Trolox（10 μmol/mL）熒光曲線到達基線狀態(tài)，說明熒光素鈉被氧自由基破壞完全，測試反應(yīng)達到終點。熒光衰退曲線下的面積隨著Trolox濃度的增大而增大。相同濃度情況下，MFAE的熒光衰退明顯比Vc減緩，即Vc在125 min時基本呈基線趨勢，而MFAE熒光衰退達到基線狀態(tài)則需要180 min。由圖1可知，可直觀地看出MFAE抗氧化能力較Vc強。

2.2 熒光衰退間隔時間對于Trolox與樣品AUC數(shù)值的影響

由圖2可知，不同間隔時間對不同濃度Trolox、MFAE和Vc的AUC數(shù)值確系有一定的影響，即從△t為1 min至△t為3 min，所有曲線下的AUC數(shù)值均逐漸減小；隨后，當(dāng)△t為4min時，所有曲線下的AUC數(shù)值增加；當(dāng)△t為5 min時，所有曲線下的AUC數(shù)值急劇下降至最低。進一步地，從不同濃度Trolox、MFAE和Vc的AUC的數(shù)值上看，不同時間間隔下得到的AUC數(shù)值卻相差不大，即同一待測物AUC的最大數(shù)值與最小數(shù)值相差的百分比分別是：1.35%（1 μmol/L Trolox）、1.32%（2 μmol/L Trolox）、1.23%（4 μmol/L Trolox）、1.13%（6 μmol/L Trolox）、1.07%（8 μmol/L Trolox）、1.00%（10 μmol/L Trolox）、1.03%（MFAE）與1.40%（Vc）。

2.3 熒光衰退間隔時間對于Trolox與樣品Net AUC數(shù)值的影響

由圖3可知，不同間隔時間對不同濃度Trolox、MFAE和Vc的Net AUC（AUCTrolox– AUCblank）也有一定的影響。例如對于1 μmol/L的Trolox，隨著間隔時間的增加，Net AUC先減小后增加，且在間隔時間△t為3 min時達到最小值，而對于10 μmol/L的Trolox，隨著間隔時間的增加，Net AUC呈線性減小；對于MFAE，其Net AUC在△t為4 min時達到最小值，而對于Vc，其Net AUC在△t為5 min時達到最小值。從不同濃度Trolox、MFAE和Vc的Net AUC的數(shù)值上看，不同時間間隔下得到的Net AUC數(shù)值相差不大，即最大數(shù)值與最小數(shù)值相差的百分比分別是：1.31%（1 μmol/L Trolox）、0.64%（2 μmol/L Trolox）、0.21%（4 μmol/L Trolox）、0.34%（8 μmol/L Trolox）、0.31%（MFAE）與1.4%（Vc）。

2.4 熒光衰退間隔時間對于桑葚提取物與維生素C的ORAC數(shù)值的影響

由圖4可知，在本實驗樣品的濃度下，桑葚花色苷提取物ORAC的數(shù)值較Vc的高，表明其抗氧化能力較強，約為Vc的5.8倍；隨著間隔時間的增加，對于桑葚提取物MFAE的ORAC值，除了在△t為4 min時下降，總體呈現(xiàn)上升趨勢；進一步地，在不同熒光衰退間隔時間下，MFAE的ORAC最大值為5527.5 μmol TE/g，最小值為5497.4 μmol TE/g，相差為30.1 μmol TE/g。對于維生素C的ORAC值，隨著間隔時間的增加首先增加，在△t為3 min時達到最大值；隨后逐漸減小，在△t為5 min時達到最小值；進一步地，在不同熒光衰退間隔時間下，Vc的ORAC最大值為953.5 μmol TE/g，最小值為942.3 μmol TE/g，相差為11.2 μmol TE/g。從不同時間間隔下得到的ORAC數(shù)值的最大值與最小值的相差百分比上來看，MFAE的是0.55%，Vc的是1.2%，表明熒光衰退間隔時間的不同對于標(biāo)準(zhǔn)物Vc與自制樣品MFAE的ORAC計算值影響較小。

3 結(jié)語

本文以維生素C和桑葚花色苷提取物為研究對象，定量地探討了選取不同熒光衰退時間間隔對于樣品ORAC值的影響。結(jié)果表明：在不同熒光衰退間隔時間下，從1 min到5 min，MFAE的ORAC最大值與最小值相差為30.1 μmol TE/g，相差百分比為0.55%；維生素C的ORAC最大值與最小值相差為11.2 μmol TE/g，相差百分比為1.2%；即熒光衰退時間間隔對于本文樣品ORAC值的影響均在2%以內(nèi)。因此，第一，本文的研究為ORAC法中選取熒光衰退間隔時間提供參考，建議可在為1～5 min范圍內(nèi)隨機選取；第二，基于手動記錄讀數(shù)的熒光酶標(biāo)儀，建議選取較長的熒光衰退間隔時間，如5 min，以有利于手動記錄，也有利于與某些檢測時間較短的試樣交叉進行。

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（責(zé)任編輯：趙中正）