三黃雞STING胞外區基因克隆及原核表達

曹艷杰 何怡寧 唐寧 王海勇 張志鵬 謝智文 韋平 韋天超 磨美蘭

摘要：【目的】克隆雞干擾素基因刺激蛋白（STING）胞外區基因并進行原核表達，為了解STING蛋白的生物學功能及探討禽類的固有免疫機制打下基礎。【方法】采用RT-PCR擴增雞STING胞外區基因，與原核表達載體pGEX-4T-1連接構建重組表達質粒，再轉化BL21（DE3）感受態細胞，經IPTG誘導表達后進行12% SDS-PAGE和Western blotting鑒定分析。【結果】三黃雞STING胞外區基因全長951 bp，與原核表達載體pGEX-4T-1可成功構建重組表達質粒pGEX-4T-1-STING，轉化BL21（DE3）感受態細胞后經1.0 mmol/L IPTG誘導表達4 h，12% SDS-PAGE電泳檢測得到一個帶GST標簽約62 ku的融合蛋白，采用抗GST多克隆抗體進行Western blotting鑒定，約在62 ku處可見一條明顯的蛋白印跡條帶，表明目的蛋白原核表達正確，且特異性較高。【結論】從三黃雞外周血淋巴細胞中克隆獲得的STING胞外區基因片段可在原核細胞中高效表達，且純化后的融合蛋白可用于制備雞STING多克隆抗體。

關鍵詞： 三黃雞；干擾素基因刺激蛋白（STING）；克隆；原核表達

中圖分類號： S831.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1401-05

Abstract：【Objective】The extracellular domain gene of chicken stimulator of interferon genes（STING） was expressed in prokaryotic cell， in order to lay the foundation for understanding biological function of STING protein and studying innate immune mechanisms of poultry. 【Method】The Sanhuang chicken STING extracellular domain gene was amplified by RT-PCR， and ligated into PGEX-4T-1 vector to construct recombinant expression plasmid PGEX-4T-1-STING. The recombinant expression plasmid was transformed into E. coli BL21（DE3） competent cell， and the recombinant strain was induced by IPTG， and the expression products were identified and analyzed by 12% SDS-PAGE and Western blotting. 【Result】The results showed that， the Sanhuang chicken STING extracellular domain gene was 951 bp in length. And the recombinant expression plasmid PGEX-4T-1-STING was constructed successfully. After the recombinant expression plasmid was transformed into E. coli BL21， the recombinant strain was induced by 1.0 mmol/L IPTG for 4 h. A 62 ku fusion protein with a GST-tag was expressed successfully， and could be detected by 12% SDS-PAGE. And the Western blotting results showed that， using anti-GST-tag polyclonal antibody， a special antibody binding band was found， with molecular mass of 62 ku， it indicated that the target protein was expressed accurately， and had high specificity. 【Conclusion】The STING extracellular domain gene is cloned from peripheral blood lymphocytes of chicken， and can be expressed at high level in prokaryotic cell. The high-purity fusion protein can be used to prepare polyclonal antibody of chicken STING.

Key words： Sanhuang chicken； stimulator of interferon genes（STING）； cloning； prokaryotic expression

0 引言

【研究意義】干擾素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes，STING）是位于內質網（或線粒體膜和其他膜結構）上的跨膜蛋白，也是參與誘導固有免疫反應的一個重要接頭蛋白（Ishikawa and Barber，2008；Jin et al.，2008），在天然免疫反應系統的抗病毒過程中發揮關鍵作用。受病毒感染后，STING首先形成二聚體活性形式，再招募TBK1及IRF3形成功能復合體，進而激活IRF3并促使其進入細胞核，誘導I型干擾素產生（Zhong et al.，2008；Sun et al.，2009）。因此，加強雞STING鑒定及誘導表達研究，對制備單因子血清及探討STING在固有免疫信號通路中的作用機制具有重要意義。【前人研究進展】Jin等（2011）研究發現，STING的泛素化可誘導其發生二聚化，也是STING招募TBK-1并磷酸化IRF3的前提條件，若經處理使其無法發生泛素化修飾，則會抑制干擾素通路。謝立蘭（2011）研究表明，超表達豬STING能激活轉錄因子IRF3和NF-kB，并誘導干擾素β（IFN-β）產生，而干擾STING表達能降低IFN-β的產生。張靜（2013）研究發現，人源STING全長有379個氨基酸，N端有4個跨膜結構域，負責將STING定位在線粒體或內質網上，C端是效應結構域，含有一系列磷酸化位點，其磷酸化活性對介導I型干擾素的激活非常重要。可見，STING缺失細胞能有效阻斷無序列特征DNA轉染或DNA病毒引起的I型干擾素產生，且部分抑制RNA病毒介導的I型干擾素產生。此外，STING依賴的信號通路對DNA疫苗引起的適應性免疫也非常必需（Ishikawa et al.，2009）。Ishikawa等（2008，2009）研究表明，缺失STING的小鼠對RNA病毒如口炎性水泡病毒、仙臺病毒及DNA病毒如單純皰疹病毒1等均有高度的敏感性，說明STING在抗病毒固有免疫中發揮重要作用。吳俊嬌（2014）研究發現，STING的cGAS/STING信號通路關鍵因子會在系統性紅斑狼瘡患者的外周淋巴細胞中表達。【本研究切入點】近年來，關于人類與哺乳動物STING基因的表達已有報道，對其蛋白晶體結構與功能也進行了深入研究，并取得了長足進展（謝立蘭，2011；張俊兵，2013），但有關禽類STING基因原核表達的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以雞的外周血淋巴細胞總RNA為模板，RT-PCR擴增STING胞外區基因片段，并將該基因片段克隆至原核表達載體pGEX-4T-1，再轉化BL21（DE3）感受態細胞，IPTG誘導STING胞外區基因表達，旨在為進一步了解雞STING蛋白的生物學功能及探討禽類相關疾病固有免疫機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

三黃雞購自廣西富鳳農牧有限公司。Phanta HS Super-Fidelity DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；抗GST標簽兔多克隆抗體（HRP標記）、BL21（DE3）感受態細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司；GST融合蛋白純化試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司；Blue Plus III Protein Marker購自北京全式金生物科技有限公司；PageRulerTM Prestained Protein Ladder購自賽默飛世爾科技公司；RNA抽提試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶EcoR I與Xho I、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1. 2 引物設計與合成

參照NCBI上的原雞STING mRNA基因序列（NM_001305152.1），利用Primer 6.0和Oligo 7設計1對擴雞STING胞外區基因全長序列的引物。上游引物（F）：5'-TAGGAATTCATGCAGCTCGGGGTGCTGCT

CAA-3'（下劃線部分為EcoR I酶切位點）；下游引物（R）：5'-TACTCGAGTCAGTCACTGCGCAGCGGCTG

GG-3'（下劃線部分為Xho I酶切位點）。引物由廣州華大基因有限公司合成。

1. 3 三黃雞STING胞外區基因擴增

采集三黃雞新鮮抗凝血樣5.0 mL，分離外周血淋巴細胞，并按參照說明進行總RNA抽提，反轉錄后進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 10 s，69 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環；72 ℃延伸5 min。反應結束后，回收純化目的條帶。

1. 4 重組表達質粒構建與鑒定

在37 ℃下用EcoR I和Xho I雙酶切STING胞外區基因和pGEX-4T-1表達載體30 min，將酶切產物分別進行純化回收，用T4連接酶連接（16 ℃，12 h）純化回收產物，轉化DH5α感受態細胞，37 ℃下搖菌1.5 h后接種于含氨芐青霉素的LA固體培養基上進行培養。提取重組質粒后，經雙酶切鑒定與PCR鑒定，篩選出陽性重組質粒并送至廣州華大基因有限公司測序。

1. 5 融合蛋白原核表達及可溶性分析

以陽性重組質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞，37 ℃下搖菌1.5 h后接種于含氨芐青霉素的LA固體培養基上，37 ℃培養12 h，挑取單菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體培養基（5.0 mL），37 ℃搖床培養，當菌液麥氏濁度單位（MCF）達0.5時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續培養4 h。離心收集菌體，進行12% SDS-PAGE電泳檢測。同時取陽性菌液20.0 mL，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS重懸沉淀部分，加入溶菌酶，菌液經-80 ℃凍融3次，然后置于細胞超聲波破碎儀上破碎30 min，5000 r/min離心10 min，分離上清液和沉淀，對其進行12% SDS-PAGE電泳檢測，鑒定融合蛋白是否為可溶性蛋白。

1. 6 融合蛋白純化

應用GST融合蛋白純化試劑盒對融合蛋白進行純化，具體操作步驟：對目的蛋白進行變性復性，將復性液加入到洗滌后的高親和力GST純化介質層析柱中，流速控制在10～15 cm/h，重復過柱3次，以增加純化介質與GST融合蛋白結合率。對純化后的產物進行12% SDS-PAGE電泳檢測，觀察純化結果。

1. 7 融合蛋白Western blotting鑒定

純化目的蛋白經12% SDS-PAGE電泳檢測后轉移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶進行封閉，4 ℃過夜，加入HRP標記的抗GST標簽兔多克隆抗體，稀釋倍數1∶4000，37 ℃孵育2 h，加入DAB底物溶液進行顯色，至出現蛋白條帶后，用三蒸水洗膜，終止顯色。

2 結果與分析

2. 1 三黃雞STING胞外區基因的擴增結果

以三黃雞外周血淋巴細胞總RNA反轉錄獲得的產物為模板進行PCR擴增，結果擴增獲得約950 bp的片段（圖1），與預期結果一致。

2. 2 重組表達質粒的鑒定結果

PCR鑒定重組表達質粒pGEX-4T-1-STING，可擴增獲得約950 bp的目的片段，與預期結果相符；對重組質粒進行單、雙酶切鑒定（分別為EcoR I和EcoR I/Xho I），酶切產物電泳后得到的目的條帶與STING胞外區基因和pGEX-4T-1載體的大小相符（圖2）。測序結果進一步證實，雞STING胞外區基因序列、插入位置及閱讀框均準確無誤，表明雞STING胞外區基因已成功克隆至原核表達載體pGEX-4T-1，重組表達質粒構建成功。

2. 3 融合蛋白的原核表達及溶解性檢測結果

重組表達質粒pGEX-4T-1-STING轉化BL21（DE3）感受態細胞后經1.0 mmol/L IPTG誘導表達4 h，進行12% SDS-PAGE電泳檢測。結果顯示，在分子量62 ku附近出現一條明顯表達的蛋白條帶（圖3），與預期結果相符。未經誘導的重組表達質粒pGEX-4T-1-STING菌液與空載體誘導菌液在分子量62 ku處均未見明顯的蛋白條帶，表明三黃雞STING蛋白原核表達成功。

為了鑒定融合蛋白的可溶性，將IPTG誘導菌液破碎后的上清液、沉淀與全菌分別進行12% SDS-PAGE電泳，結果顯示，原核表達的三黃雞STING蛋白在上清液中幾乎不表達，而在沉淀中大量表達（圖4），表明目的蛋白主要是以包涵體的形式進行表達。

2. 4 融合蛋白的純化結果

原核表達目的蛋白進行變性復性后以高親和力GST純化介質層析柱進行蛋白純化，將純化后的融合蛋白樣品與純化前的融合蛋白樣品進行12% SDS- PAGE電泳檢測，結果顯示，純化前的融合蛋白純度較差，雜蛋白較多；純化后的融合蛋白比較單一，雜蛋白條帶消失（圖5）。

2. 5 純化融合蛋白的Western blotting鑒定結果

將純化的融合蛋白進行Western blotting鑒定，結果顯示，純化融合蛋白能被HRP標記的抗GST標簽兔多克隆抗體識別，并發生特異性結合，約在62 ku處可見一條明顯的蛋白印跡條帶（圖6），表明目的蛋白原核表達正確，且特異性較好。

3 討論

近年來，有關機體固有免疫的研究已取得了長足進展，特別是固有免疫識別受體和病原相關分子模式的發現、鑒定及其概念的提出意義重大。STING是固有免疫系統I型干擾素信號通路中的一個重要接頭蛋白，定位在內質網（或稱在線粒體膜和其他膜結構）上，能強烈刺激I型干擾素和白介素等免疫炎癥因子的產生（Ishikawa and Barber，2008；Zhong et al.，2008；Sun et al.，2009）。STING以STING/TBK1/IRF3為軸心模式，介導DNA、RNA、病原性小分子誘導的固有免疫反應，從而發揮抗病毒作用（謝欣等，2014）。STING在人體的多種組織細胞中廣泛表達，尤其在與免疫相關的組織細胞中高度表達，如胸腺、心、脾臟、胎盤、肺臟及外周血白細胞，提示其在免疫調節方面可能具有十分重要的功能作用（Jin et al.，2008；Ishikawa and Barber，2008；Zhong et al.，2008）。Cheng等（2015）研究發現，雞STING能高效誘導干擾素刺激基因（ISGs）的表達，促進I型干擾素產生，從而發揮抗病毒作用，進一步佐證MDA5可通過STING誘導干擾素的觀點。可見，STING在病毒誘導固有免疫應答的信號通路中扮演著重要角色。

在進行雞STING基因原核表達研究中，本課題組曾嘗試采用pET-32a表達載體，再轉化至BL21（DE3） pLysS和Rosetta（DE3）細胞中進行表達，但均未獲得滿意效果。原核表達載體pET-32a含有高效的T7 lac啟動子、組氨酸標簽和T7終止子，被認為是目前大腸桿菌系統表達重組蛋白的最有效工具之一（Kang et al.，2007），但由于雞STING是由胞內區（1～27 aa）、跨膜區（28～50 aa）和胞外區（51～379 aa）3部分組成，跨膜區對目的蛋白在大腸桿菌的體內表達具有很大干擾作用，在表達前必須去除跨膜區。因此，本研究重新設計擴增雞STING胞外區基因引物，去除N端的胞內區與跨膜區片段，以排除N端跨膜區在蛋白表達過程中的干擾作用，結果發現STING蛋白得到高水平表達，與李中華等（2015）應用原核表達系統表達傳染性支氣管炎病毒S1蛋白的結論一致，故推測跨膜區的存在是前期表達失敗的主要原因。

4 結論

從三黃雞外周血淋巴細胞中克隆獲得的STING胞外區基因片段可在原核細胞中高效表達，且純化后的高純度融合蛋白可用于制備雞STING多克隆抗體，對進一步探討該蛋白的生物學功能及禽類的固有免疫機制具有重要意義。

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（責任編輯 蘭宗寶）