廣西巴馬小型豬PAQR3基因克隆及表達譜分析

司景磊 黃玥萌 李龍 陳秋明 嚴雪瑜 吳延軍 張笠

摘要：【目的】克隆廣西巴馬小型豬孕激素和脂聯素分子受體3（PAQR3）基因，并研究該基因在廣西巴馬小型豬不同組織中的表達特性，為揭示PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基礎。【方法】采用RT-PCR擴增廣西巴馬小型豬PAQR3基因，應用在線預測軟件對其功能和結構進行生物信息學分析，并以qRT-PCR分析PAQR3基因在不同組織中的表達特性及高脂高糖誘導后的表達水平。【結果】廣西巴馬小型豬PAQR3基因編碼區（CDS）序列全長936 bp，編碼312個氨基酸，與人類（XM_006714106.2）、獼猴（NM_001257693.1）、牛（XM_010806259.1）、家犬（XM_014109889.1）、家鼠（XM_ 006534874.2）、羊（XM_012180242.1）、雞（ XM_001233720.3） PAQR3氨基酸序列的一致性在81%以上，其中與獼猴的親緣關系最近，與牛的親緣關系相對較遠。PAQR3蛋白氨基酸序列包含保守的HlyIⅡ結構域，為親水性蛋白，有7個跨膜螺旋結構；其二級結構主要是延伸鏈，占31.83%；該蛋白不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。qRT-PCR分析結果表明，PAQR3基因在廣西巴馬小型豬的不同組織中均有表達，以在肺臟中的表達量最高、脂肪中的表達量最低；經高脂高糖誘導后，PAQR3基因在廣西巴馬小型豬肝臟組織中的表達水平顯著降低（P<0.05）。【結論】PAQR3基因在廣西巴馬小型豬不同組織中廣泛表達，在膽固醇和甘油三脂充裕的條件下，機體可通過下調PAQR3基因的表達量來平衡膽固醇含量。

關鍵詞： 廣西巴馬小型豬；PAQR3基因；克隆；表達譜分析

中圖分類號： S828.89 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1390-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to clone progesterone and adipoQ receptor 3（PAQR3） gene of Guangxi Bama mini-pig and investigate its expresssion in different tissues of Guangxi Bama mini-pig， in order to lay a foundation for revealing PAQR3 fuction and its role in disease models. 【Method】The PAQR3 gene of Guangxi Bama mini-pig was cloned by RT-PCR， the protein structure of porcine PAQR3 was analyzed based on bioinformatics using online prediction software. The PAQR3 gene expression pattern in different tissues and its expression level after being induced by high fat and high sugar were detected by qRT-PCR. 【Result】The results showed that， the PAQR3 gene of Guangxi Bama mini-pig was 936 bp in length， encoding 312 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that， and the amino acid sequence of porcine PAQR3 protein shared identity of more than 81% with human（XM_006714106.2）， macaque（NM_001257693.1）， cattle（XM_010806259.1）， canis famliliaris（XM_014109889.1）， house mouse（XM_0065348

74.2）， sheep（XM_012180242.1） and chicken（XM_001233720.3）. It indicated that Guangxi Bama mini-pig had the closest genetic relationship with macaque， but the most distant genetic relationship with cattle. Furthermore， PAQR3 protein contained conserved HlyIⅡ domain and was hydrophilic protein， with 7 transmembrane helices， and the extended strand accounted for 31.83% in the secondary structure. And PAQR3 protein wasnt secretory protein because it had no signal peptide. The qRT-PCR results showed that， PAQR3 gene was expressed in the different tissues of Guangxi Bama mini-pig， especially in lung at the highest level， but in fat at the lowest level. In addition， after being induced by high fat and high sugar， the expression level of PAQR3 gene was reduced significantly in liver tissues of Guangxi Bama mini-pig（P<0.05）. 【Conclusion】Th PAQR3 gene can be expressed widely in different tissues of Guangxi Bama mini-pig， and under high content of cholesterol and triglyceride， body can balance cholesterol content by regulating PAQR3 gene expresssion.

Key words： Guangxi Bama mini-pig； PAQR3 gene； cloning； expression patterns analysis

0 引言

【研究意義】孕激素和脂聯素分子受體3（Progesterone and adipoQ receptor 3，PAQR3）又名RKTG（Raf kinase trapping to golgi），為PAQRs家族中的一員，是具有7次跨膜結構且N端在外、C端在胞內的膜蛋白受體（Yamauchi et al.，2003；Feng et al.，2007；Luo et al.，2008）。PAQRs家族在哺乳動物中有11個成員，即PAQR1～PAQR11（Tang et al.，2005），其成員的功能各不相同，主要是由于具有非保守性的N末端和C末端結構（陳雁和謝小多，2009）。因最初發現某些成員具有與脂聯素或孕酮相似的生物學功能，故被命名為孕酮及脂聯素受體家族（Tang et al.，2005）。PAQR3能參與細胞的多種信號通路，特別是與癌癥發生發展相關的信號通路，其在乳腺癌、胃癌、直腸癌等腫瘤組織中的表達水平降低，進而增強乳腺癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性（李日恒等，2015；宋艷敏等，2015）。因此，研究PAQR3基因在不同組織中的表達特性對揭示其功能具有重要意義。【前人研究進展】自PAQR3被發現以來，其功能多樣性正逐步被報道。Greene和Tischler（1976）研究表明，PAQR3基因過表達能抑制神經生長因子誘導的P12細胞分化；Fan等（2008）研究表明，PAQR3通過在空間上調控Raf激酶而達到抑制Ras/ Raf/MEM/ERK信號通路的目的；Wang等（2013）研究證實，PAQR3在調節機體能量代謝、肥胖及胰島素信號通路方面發揮重要作用；宋艷敏等（2015）研究發現，結直腸癌組織中PAQR3基因表達降低與啟動子發生高甲基化密切相關；而李日恒等（2015）通過結直腸癌組織甲基化特異性檢測，發現結直腸癌組織中PAQR3基因甲基化與性別、年齡和腫瘤部位無關。此外，PAQR3基因過表達和敲除分別能夠降低或增強PI3K活性及PIP3的產生（王笑等，2013）；在機體膽固醇水平較低的條件下，PAQR3能夠將Scap/SREBP2錨定于高爾基體上，從而調節機體膽固醇的合成（Xu et al.，2015）。【本研究切入點】PAQR3不僅在抑制癌細胞生成方面有積極作用，還在膽固醇和脂肪酸的合成與代謝、胰島素抵抗信號通路等方面發揮重要作用（Wang et al.，2012；Xu et al.，2015），但目前針對豬PAQR3基因表達尚無研究報道。【擬解決的關鍵問題】應用RT-PCR擴增廣西巴馬小型豬PAQR3基因編碼區（CDS）序列，應用在線預測軟件對其功能和結構進行生物信息學分析，并以qRT-PCR分析PAQR3基因mRNA在不同組織中的表達特性及高脂高糖誘導后的表達水平，以期為進一步研究PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西巴馬小型豬樣品由廣西大學動物遺傳育種實驗室保存提供。除LA Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、SYBP■ Green I定量試劑盒、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體、DNA回收試劑盒、DH5α感受態細胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司外，其他試劑均購自TaKaRa公司。

1. 2 組織總RNA提取

采用Trizol提取廣西巴馬小型豬肝臟組織總RNA，以核酸儀檢測所提取RNA的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA完整性。cDNA第一鏈的合成按TaKaRa試劑盒說明進行操作，反轉錄產物-20 ℃保存備用。

1. 3 PAQR3基因克隆及定量引物

根據GenBank上已公布的豬PAQR3基因CDS序列（登錄號XM_013998797.1）設計PAQR3基因擴增引物PAQR3-F1和PAQR3-R1，同時針對PAQR3、SREBP2（固醇調節元件結合蛋白2）、HMGCS（3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因）、HMGCR（HMGCoA還原酶）、LDLR（低密度脂蛋白受體）、ABCA1（三磷酸腺苷結合盒轉運體A1）等基因分別設計不同的熒光定量PCR（qRT-PCR）擴增引物，包括PAQR3-F2/R2、SREBP2- F/R、HMGCS-F/R、HMGCR-F/R、LDLR-F/R、ABCA1- F/R及管家基因GAPDH（內參基因），所有引物均由深圳華大基因研究院合成（表1）。以廣西巴馬小型豬肝臟cDNA為模板進行目的片段擴增，PCR反應體系50.0 μL：cDNA模板1.0 μg，10 μmol/L的上、下游引物（PAQR3-F1/PAQR3-R1）各0.5 μL，LA Taq DNA聚合酶12.5 μL，加ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1. 4 目的片段克隆

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段大小，并切膠回收連接至pMD19-T載體（膠回收產物4.0 μL、Ligase Buffer 5.0 μL、pMD19-T載體1.0 μL），然后轉化DH5α感受態細胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LA培養基上，37 ℃下倒置培養過夜（10 h）后挑選陽性克隆進行菌液PCR驗證，將陽性菌落送至華大基因研究院進行測序鑒定。

1. 5 PAQR3基因生物信息學分析

將測序結果用Lasergene 7.0進行序列比對分析，用MEGA 6.0進行同源性比對并構建系統發育進化樹。利用ExPASy數據庫中的ProtParam預測PAQR3基因所編碼蛋白的親/疏水性、氨基酸組成和理化性質、跨膜結構域等生物學信息。

1. 6 PAQR3基因在不同組織中的表達水平分析

以稀釋后的cDNA為模板進行qRT-PCR，反應體系：SYBP Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，cDNA模板5.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 4.2 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 1 s，進行40個循環。利用2-△△Ct計算PAQR3基因的相對表達量。所有樣品進行3個重復，且均設陰性對照。

1. 7 統計分析

采用SPSS 22.0統計分析PAQR3基因的表達水平，以Duncans多重和單因素方差分析比較其差異顯著性。

2 結果與分析

2. 1 PAQR3基因CDS序列和氨基酸序列分析結果

以廣西巴馬小型豬肝臟cDNA為模板，用PAQR3-F1和PAQR3-R1引物能擴增出1條特異性條帶，長度約930 bp（圖1），與預期結果一致。

將目的片段膠回收后連接至pMD19-T載體，再轉化DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，結果獲得1條清晰的目的條帶（圖2），即表明菌液測序驗證結果正確。

擴增獲得的PAQR3基因CDS序列全長936 bp，編碼312個氨基酸，與NCBI已公布的豬PAQR3基因序列（XM_013998797.1）的同源性為100%，與人類（XM_006714106.2）、獼猴（NM_001257693.1）、牛（XM_

010806259.1）、家犬（XM_014109889.1）、家鼠（XM_

006534874.2）、羊（XM_012180242.1）、雞（XM_001233-

720.3）PAQR3氨基酸序列的一致性分別為93%、92%、91%、93%、89%、92%和81%，說明PAQR3基因具有高度保守性。利用MEGA 6.0構建系統發育進化樹，發現廣西巴馬小型豬與獼猴的PAQR3基因親緣關系最近，而與牛PAQR3基因的親緣關系相對較遠（圖3）。

2. 2 PAQR3基因理化性質預測及蛋白保守域分析結果

2. 2. 1 PAQR3基因的理化性質及結構預測結果 使用ExPASy在線網站進行PAQR3基因編碼蛋白親/疏水性分析，結果顯示，廣西巴馬小型豬PAQR3蛋白平均親水數為0.403，屬于親水蛋白（圖4）。ProtScale程序預測得到PAQR3蛋白的理論等電點（pI）為9.15，分子量為21893.6。用TMHMM程序預測PAQR3蛋白的7個跨膜螺旋區，結果（圖5）發現7個跨膜螺旋的位置分別位于PAQR3蛋白序列中的第74～96、106～128、141～163、173～195、202～224、239～256和276～298位氨基酸殘基處。SOPMA網站預測PAQR3蛋白二級結構，結果顯示，α-螺旋占31.19%，延伸鏈占31.83%，β-轉角占11.90%，無規則卷曲占25.08%。利用PSORTⅡ預測PAQR3蛋白的細胞器定位，發現其分布概率為：內質網47.8%，線粒體34.8%，囊泡分泌系統4.3%，細胞核13.0%。SingIP 4.1 Server在線預測信號肽發現PAQR3不存在信號肽，即該蛋白不屬于分泌蛋白。

2. 2. 2 PAQR3蛋白保守域分析結果 根據NCBI網站BLAST檢索結果分析PAQR3蛋白保守結構域，結果顯示，廣西巴馬小型豬PAQR3蛋白氨基酸序列符合蛋白質結構的特點，包含保守的HlyIⅡ結構域（圖6）。2. 3 PAQR3基因在不同組織中的表達水平分析結果

2. 3. 1 PAQR3基因在10種不同組織中的表達譜 以廣西巴馬小型豬不同組織的cDNA為模板，分別進行PAQR3基因和GAPDH基因的qRT-PCR擴增分析，結果表明，PAQR3基因在肺臟中的表達量最高，而在脂肪中的表達量最低（圖7）。

2. 3. 2 高脂高糖誘導對PAQR3基因表達的影響 以高脂高糖飼料飼喂廣西巴馬小型豬12個月，以正常的飼料營養水平為對照。采集廣西巴馬小型豬肝臟并提取cDNA為模板，qRT-PCR擴增分析相關基因和內參基因的表達情況，結果（圖8）表明，高脂高糖誘導后廣西巴馬小型豬肝臟的PAQR3基因表達量顯著低于對照組（P<0.05），LDLR基因表達量極顯著低于對照組（P<0.01），其他基因的表達量與對照組無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

自PAQR3被發現至今，已不斷展現其在不同方面和代謝信號通路的作用，起初關于PAQR3的研究主要集中于癌癥方面，包括抑制結直腸癌、膀胱癌和肝癌的發生發展（Wu et al.，2014；Xiu et al.，2014；Yu et al.，2014）。PAQR3在調節由飲食誘導的肥胖、能量代謝、胰島素抵抗中同樣具有顯著作用。如PAQR3基因敲除鼠經高脂高糖誘導16周后能有效抵抗肥胖和機體脂肪的生成，且其血液膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著低于野生組（Wang et al.，2013）。機體膽固醇、脂質代謝是人類許多疾病發生發展的基礎，如與糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病密切相關（Xu et al.，2015）。機體膽固醇合成主要通過食物吸收和體內膽固醇合成，在哺乳動物中，膽固醇從頭合成是機體膽固醇需求的一種重要方式（Xu et al.，2015）。本研究通過檢測高脂高糖誘導廣西巴馬小型豬肝臟PAQR3基因表達量及調控膽固醇合成與代謝的相關基因，發現高脂高糖誘導后PAQR3基因顯著下調，同時調控膽固醇合成的相關基因下調表達、調控膽固醇代謝的相關基因上調表達。

PAQR3雖屬于脂聯素受體家族成員，但有報道指出，同時敲除AdipoR1和AdipoR2基因能引起胰島素抵抗和葡萄糖耐受性，提高組織甘油三酯含量和炎癥氧化應激（Yamauchi et al.，2007）；僅敲除AdipoR2基因也能促進鼠Ⅱ型糖尿病發生（Liu et al.，2007）。與之相反，敲除PAQR3基因能提高能量代謝和胰島素敏感性，可區別于脂聯素受體敲除的表型（Wang et al.，2013）。PAQR3發揮這些作用主要是通過錨定p110α，從而在空間上調控PI3K信號通路來調控胰島素信號通路。本研究克隆獲得廣西巴馬小型豬PAQR3基因CDS序列，全長936 bp，其核苷酸序列與人類、獼猴、牛、家犬、家鼠等核苷酸序列具有很高的一致性（在81%以上），且符合其家族蛋白的典型特征。PAQR3基因在廣西巴馬小型豬不同組織中廣泛表達，以在肺臟中的表達量最高、脂肪中的表達量最低；經高脂高糖誘導后肝臟中的PAQR3基因表達量顯著下調，說明在膽固醇和甘油三脂充裕的條件下，機體可通過下調PAQR3基因的表達量來平衡膽固醇含量。Xu等（2015）研究表明，PAQR3是通過將SREBPs/Scap錨定于高爾基體上而促進膽固醇合成，但本課題組的前期研究結果表明，經高脂高糖誘導廣西巴馬小型豬血液中膽固醇與甘油三酯的含量較對照組顯著提高（宋少銳，2014），可能是在機體負反饋調節作用下，PAQR3發生錨定作用的可能性微小，同時Scap將SREBP2錨定于內質網，通過下調膽固醇合成相關基因的表達來降低膽固醇合成，但具體原理有待進一步探究。

4 結論

PAQR3基因在廣西巴馬小型豬不同組織中廣泛表達，在膽固醇和甘油三脂充裕的條件下，機體可通過下調PAQR3基因的表達量來平衡膽固醇含量。

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（責任編輯 蘭宗寶）