酶解法提取大高良姜多糖工藝優化及抗氧化活性分析

劉源 張孝琴 王譯偉 楊剛

摘要：【目的】優化酶解法提取大高良姜多糖工藝，并分析其抗氧化活性，為大高良姜多糖的有效利用提供技術支持?！痉椒ā恳远嗵翘崛÷蕿樵u價指標，在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman（PB）試驗法對影響大高良姜多糖提取率的5個因素進行篩選；根據PB試驗結果，選取3個主要影響因素，通過Box-Behnken響應面試驗對提取工藝進行優化，確定最佳工藝條件；同時測定大高良姜多糖對DPPH和ABTS自由基的清除率?！窘Y果】酶解法提取大高良姜多糖最佳工藝條件：料液比1∶24、pH 6.0、酶解時間50.5 min、酶解溫度44 ℃、酶用量2%，在此條件下多糖提取率為13.53%。與傳統熱水浸提法比較，酶解法提取時間縮短72.0%，提取率提高24.1%。大高良姜多糖對DPPH和ABTS自由基均有較強的清除能力，其半數有效質量濃度（IC50）分別為2.21 mg/mL和2.15 g/mL?！窘Y論】響應面試驗模型能較好優化酶解法提取大高良姜多糖工藝，優化后的工藝具有操作簡單、省時高效、無毒環保等優點，提取得到的多糖有較強的抗氧化能力，可為后續開發利用大高良姜提供技術支持。

關鍵詞： 大高良姜多糖；酶解法；Plackett-Burman試驗法；Box-Behnken響應面法；抗氧化活性

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1376-07

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharide from Alpinia galanga Willd. by enzymolysis method was optimized， in order to provide technical support for effectively using polysaccharide from A. galanga. 【Method】With extraction rate of polysaccharides as index， the five factors affecting extraction rate of polysaccharides from A. galanga were screened by Plackett-Burman method on the basis of single factor experiment. According to the results of Plackett-Burman test， three main influencing factors were selected. Then the extraction process was optimized by by using the Box-Behnken response surface method， so as to determine optimum process conditions. Meanwhile， the scavenging rate of polysaccharide from A. galangal to DPPH free radical and ABTS free radical was determined. 【Result】The optimum process conditions of extracting polysaccharides were as follows： solid-liquid ratio of 1∶24， pH of 6.0， enzymolysis time of 50.5 min， enzymolysis temperature of 44 ℃， enzyme dosage of 2%. Under the above optimum conditions， the extraction rate of polysaccharide was 13.53%. Compared with traditional hot-water extraction method， the enzymolysis method took shorter time， so the extraction time was shortened by 72.0%， but the extraction rate was increased by 24.1%. Furthermore， polysaccharide from A. galanga had strong ability to scavenge DPPH and ABTS free radicals， and the half effective mass concentration（IC50） was 2.21 mg/mL and 2.15 g/mL， respectively. 【Conclusion】The response surface experimental model can optimize extraction process of polysaccharide from A. galangal， the enzymatic method can improve the extraction rate of polysaccharides. The extraction process has the advantages of simple operation， time saving， high efficiency， no toxicity and environmental protection， etc.， and extracted polysaccharide has more stronger antioxidant activity， therefore this process can provide scientific basis for development of A. galangal in future.

Key words： Alpinia galangal Willd. polysaccharide； enzymolysis method； Plackett-Burman test； Box-Behnken response surface method； antioxidant activity

0 引言

【研究意義】大高良姜又名大良姜、良姜、山姜，為姜科山姜屬植物大高良姜[Alpinia galanga（L.） Willd.]的根莖，是《中國藥典》收錄的藥用植物，果實入藥稱為紅豆蔻。根莖粗壯、圓形、有節，棕紅色并略有辛辣味，能溫胃、散寒、行氣止痛（趙志禮等，2001），常用作調經劑、催欲劑、墮胎藥、驅風劑、退熱劑和抗炎藥等，也可用于治療支氣管炎、心臟疾病、慢性腸炎、腎結石、糖尿病及風濕病等疾?。↘aushik et al.，2011）。已有研究發現，姜科植物多糖具有抗腫瘤、調節免疫、抗氧化等作用（李世杰等，2013）。因此，研究大高良姜多糖的提取工藝及抗氧化活性，對其藥用開發與利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前對大高良姜的研究主要集中于黃酮和色素的提取工藝研究，如黃俊生等（2010）優化熱水浸提大高良姜色素的工藝條件；牛付閣（2011）研究熱水提取大高良姜黃酮工藝；彭晶等（2013）利用酶法提取大高良姜黃酮，并對其工藝進行優化。近年來，有關姜科植物的多糖提取研究較少，樊亞鳴等（2007）對微波—水溶液提取春砂仁多糖的工藝進行優化，結果表明，在液固比10∶1、微波功率600 W、提取溫度80 ℃的條件下提取20 min，多糖產率為11.33%；鄭義等（2014）利用熱水浸提高良姜多糖，在最佳工藝條件（液料比43∶1、浸提溫度95 ℃、浸提時間3 h）下獲得多糖產率11.81%。而有關大高良姜有效成分的抗氧化活性研究報道甚少，至今僅有王蓓蓓等（2011）比較研究高良姜與大高良姜總黃酮抗氧化活性，結果發現大高良姜中總黃酮的抗氧化活性強于高良姜?！颈狙芯壳腥朦c】酶解法提取是通過纖維素酶破壞提取植物細胞，使內部物質從細胞中釋放出來，降低提取難度，具有高效、無毒等優點，已廣泛應用于植物多糖的提取（汪財生等，2010；周立等，2014），但目前尚無利用此法提取大高良姜多糖的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用Design-Expert 8.0.6軟件，將Plackett-Burman（PB）試驗和Box-Behnken響應面試驗相結合，優化酶解法提取大高良姜多糖的工藝，并研究其抗氧化活性，旨在為大高良姜多糖的有效利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大高良姜采自四川省瀘州市龍馬潭區特興鎮魏園村黃金山生態園，除去莖葉雜質，經清水沖洗后切片曬干，粉碎過60目篩備用。纖維素酶（酶活單位≥50 U/mg，最適溫度30～60 ℃，最適pH 4.0～6.5）購自江蘇銳陽生物科技有限公司，DPPH購自美國Sigma公司，ABTS購自碧云天生物技術有限公司，維生素C（Vc）購自東北制藥集團有限公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮、乙醚、無水乙醇均為國產分析純。主要儀器設備：RE52CS-1旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、MCR-3S微波爐（西安予輝儀器有限公司）、SP-1901型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、FW80-1粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 大高良姜多糖提取 準確稱取大高良姜粉→添加一定量的酶→加入50%乙醇溶解→調節pH→控制酶解溫度→水浴鍋酶解提取→90 ℃滅酶30 min→抽濾→定容→計算提取率。

1. 2. 2 多糖提取率測定 以葡萄糖質量濃度為x軸、490 nm處測定的吸光值為y軸，擬合回歸曲線，得回歸方程：y=156.3x+2.858（R2=0.9992），繪制得標準工作曲線。

多糖提取率（%）=提取得到的多糖質量/原料總質量×100

1. 2. 3 單因素試驗 采用控制變量法，依次改變料液比、酶解時間、酶解溫度、pH、酶用量5個因素，結合標準工作曲線，以多糖提取率為評價指標進行分析。

1. 2. 4 PB試驗設計 在單因素試驗的基礎上，對上述5個因素進行篩選試驗，試驗因素水平如表1所示，再根據試驗結果確定影響顯著的因素進行響應面試驗。

1. 2. 5 Box-Behnken響應面試驗設計 在單因素試驗和PB篩選試驗的基礎上，對所確定的因素進行響應面試驗，確定最佳多糖提取工藝條件，試驗因素水平如表2所示。

1. 2. 6 對比試驗 采用響應面試驗優化工藝進行酶解法提取試驗，再結合傳統熱水浸提法的結果，比較兩種方法對大高良姜多糖提取率的優劣性。

1. 2. 7 多糖抗氧化活性測定

1. 2. 7. 1 DPPH自由基清除率測定 將大高良姜多糖配成不同質量濃度的溶液，分別取2.0 mL置于容量瓶中，再分別加入2.0 mL 1 mmol/L DPPH溶液，混勻后于25 ℃避光反應30 min，在517 nm處測定吸光值A1。同時取2.0 mL不同質量濃度多糖溶液，分別加入2.0 mL 95%乙醇后，測定吸光值A2。最后取2.0 mL蒸餾水加入2.0 mL 1 mmol/L DPPH溶液測定吸光值A0，根據公式計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）=（1-■）×100

1. 2. 7. 2 ABTS自由基清除率測定 先配制ABTS工作液，再分別取0.1 mL稀釋后的不同質量濃度大高良姜多糖提取液與3.9 mL ABTS工作液混合成樣品液，室溫避光反應6 min后測定樣品液在734 nm處的吸光值A；以0.1 mL蒸餾水與3.9 mL ABTS工作液混合進行空白試驗，測定吸光值A0，根據公式計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率（%）=■×100

1. 3 統計分析

采用SPSS 19.0進行單因素方差分析；采用Design-Expert 8.0.6進行響應面分析。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 料液比對大高良姜多糖提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間2.0 h、酶用量3%，考察不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40）對大高良姜多糖提取率的影響，結果見圖1。開始時隨著料液比的降低，大高良姜多糖提取率逐漸增大，當料液比小于1∶25時，多糖提取率反而減少；其中料液比為1∶25時提取率最高（11.68%），與料液比1∶30和1∶35的提取率無顯著差異（P>0.05，下同）。因此，選擇料液比1∶20和1∶30進行PB試驗。

2. 1. 2 酶解時間對大高良姜多糖提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、酶用量3%、料液比1∶30，考察不同酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）對大高良姜多糖提取率的影響，結果見圖2。多糖提取率隨酶解時間的延長逐漸增大，酶解時間為1.0 h時達最大值，且多糖提取率與0.5、2.0、2.5 h的多糖提取率有顯著差異（P<0.05，下同）；酶解時間過長（超過1.0 h），多糖提取率逐漸下降。最終選擇0.5和1.5 h作為PB試驗的酶解時間。

2. 1. 3 酶解溫度對大高良姜多糖提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解時間2.0 h、酶用量3%、料液比1∶30，考察不同酶解溫度（35、40、45、50和55 ℃）對大高良姜多糖提取率的影響，結果見圖3。大高良姜多糖提取率隨著酶解溫度的升高逐漸增加，超過45 ℃后逐漸下降；酶解溫度在40～55 ℃范圍內多糖提取率無顯著性差異，最終選擇40和50 ℃作為PB試驗的酶解溫度。

2. 1. 4 pH對大高良姜多糖提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，固定酶解溫度50 ℃、酶解時間2.0 h、酶用量3%、料液比1∶30，考察不同pH（4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）對大高良姜多糖提取率的影響，結果見圖4。根據圖中多糖提取率隨著pH變化的規律，發現pH為6.0時多糖提取率最高，之后多糖提取率減少，pH在5.0～6.5范圍內多糖提取率無顯著性差異，因此選擇pH 5.5和6.5進行PB試驗優化。

2. 1. 5 酶用量對大高良姜多糖提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間2.0 h、料液比1∶30，考察不同酶用量（1%、2%、3%、4%和5%）對大高良姜多糖提取率的影響，結果見圖5。根據圖中多糖提取率隨酶用量變化的規律，發現在酶用量2%～5%范圍內，多糖提取率的變化不顯著，但在酶用量2%～3%時出現小幅高峰值，因此選擇酶用量為1%和3%進行PB試驗。

2. 2 響應面優化大高良姜多糖提取工藝

2. 2. 1 PB試驗篩選顯著影響大高良姜多糖提取率的因素 綜合單因素試驗結果，運用Design-Expert 8.0.6設計12次PB試驗，進行料液比（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）、pH（D）、酶用量（E）5個因素對多糖提取率的顯著性考察，其試驗結果見表2。表3為上述5個因素對多糖提取率的回歸方程系數及顯著性檢驗結果，由表3可知，酶解溫度和酶解時間對大高良姜多糖提取率影響極顯著（P<0.01，下同），料液比影響顯著。結合考慮實際生產的需求，確定pH為6.0、酶用量為2%，選擇料液比、酶解溫度和酶解時間為響應面試驗考察因素。

2. 2. 2 響應面試驗結果 根據Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken響應面試驗設計原理，綜合單因素試驗和PB試驗結果，確定料液比、酶解時間、酶解溫度為主要因素，設計3因素3水平響應面分析試驗，其方案及結果如表5所示。采用Design-Expert 8.0.6對表5數據進行多元回歸擬合分析，得到模型的擬合曲線方程為：Y=13.35-0.21A-0.36B-0.38C+0.70AB+0.47AC+

0.022BC-1.15A2-0.83B2-1.15C2。

對模型進行回歸系數和方差分析的顯著性檢驗，結果見表6。由表6可知，該模型的Prob>F，為0.0001（小于0.01），表明該模型的回歸方程具有顯著性。3個因素對大高良姜多糖提取率影響排序為：C（酶解溫度）>B（酶解時間）>A（料液比），其中，作用顯著的是B和AC，極顯著的是C、AB、A2、B2和C2。

2. 2. 3 響應面分析因素之間的交互作用 根據擬合回歸方程，固定料液比、酶解時間和酶解溫度中的任意兩個因素為零水平時，作出兩個交互項的響應面圖，以考察其對大高良姜多糖提取率的影響，見圖6～圖8。響應曲面坡度較平滑，說明響應值受各變量變化的影響較??；響應曲面坡度較陡峭，則說明響應值受變量交互作用較明顯。從圖6～圖8可以看出，料液比與酶解時間交互作用的坡度最陡峭，說明影響最顯著，而酶解溫度與酶解時間的響應面坡度先升高后逐漸趨于平緩，說明影響不顯著。這與響應面方差分析結果相一致。

2. 2. 4 最佳提取條件的確定和驗證 利用Design-

Expert 8.0.6得到最佳提取工藝為：料液比1∶23.85、酶解時間0.84 h、酶解溫度43.93 ℃，在此條件下大高良姜多糖提取率的預測值為13.4718%。綜合考慮多糖提取率和試驗可操作性等因素，修正最優工藝條件為：料液比1∶24、pH 6.0、酶解時間50.5 min、酶解溫度44 ℃，酶用量2%，對其進行驗證，得到實際測定值為13.53%，相對誤差0.43%。表明本研究建立的模型推測得到的最佳工藝參數對實際預測較可靠，有一定指導意義。

2. 3 傳統熱水浸提法和酶解法比較結果

改變1.2.1提取工藝，采用傳統熱水浸提法進行試驗，確定料液比1∶24、浸提時間3 h、浸提溫度95 ℃，多糖提取率為10.90%。與傳統熱水浸提法相比較，酶解法的提取時間縮短72.0%，提取率提高24.1%，酶解法提取大高良姜多糖的效果更佳。

2. 4 大高良姜多糖抗氧化活性分析結果

2. 4. 1 大高良姜多糖對DPPH自由基的清除效果 大高良姜多糖對DPPH自由基的清除作用結果見圖9，以Vc為參照，DPPH自由基清除能力隨大高良姜多糖質量濃度的增大而增強，清除率最大值為85.74%，清除能力略低于Vc。大高良姜多糖的半數有效質量濃度（IC50）為2.21 mg/mL。

2. 4. 2 大高良姜多糖對ABTS自由基的清除效果 大高良姜多糖對ABTS自由基的清除作用結果見圖10，多糖質量濃度在1.00～5.00 g/mL范圍內，其對ABTS自由基的清除率高于Vc，大高良姜多糖的IC50為2.15 g/mL。

3 討論

目前，對大高良姜同屬姜科類植物的多糖提取多采用傳統工藝，如王曉梅等（2011）采用水提醇沉法提取生姜多糖，平均提取率為7.58%；鄭義等（2014）采用熱水浸提高良姜多糖，得到提取率11.81%。本研究利用纖維素酶水溶液破壞大高良姜的細胞壁，極大改善細胞壁的通透性，最大程度地溶出多糖化合物；在單因素試驗的基礎上，將PB試驗和響應面試驗相結合進行擬合，優化得到酶解法提取大高良姜多糖的提取工藝為：料液比1∶24、pH 6.0、酶解時間50.5 min、酶解溫度44 ℃、酶用量2%，在此條件下多糖提取率為13.53%，明顯高于與其他姜科類植物的多糖提取率，如樊亞鳴等（2007）測定的春砂仁多糖提取率11.33%，鄭義等（2013）測定的益智仁多糖提取率7.71%。與傳統熱水浸提法比較，采用酶解法提取大高良姜多糖所需時間縮短72.0%、能源消耗減少53.7%、提取率提高24.1%，說明采用響應面試驗優化的酶解法提取大高良姜多糖更有效。

姜科類植物多糖均具有較強的抗氧化活性，鄭義等（2013）研究益智仁多糖抗氧化活性的結果表明，益智仁多糖質量濃度為2 g/L時，其對DPPH的清除率達90.06%；鄭義等（2014）對高良姜多糖的抗氧化活性進行研究，發現高良姜多糖質量濃度為5 g/L時，其對DPPH的清除率達98.36%。本研究對大高良姜多糖的抗氧化活性進行分析，結果表明，大高良姜多糖對DPPH和ABTS自由基均有一定的清除能力；隨著大高良姜多糖質量濃度的不斷增大，多糖的抗氧化能力也不斷增強，其IC50分別為2.21 mg/mL和2.15 g/mL。

目前對于大高良姜多糖的研究尚處于初級階段，后續應對其結構鑒定和藥理性質進行相關研究，以及對比分析大高良姜整株的不同部位多糖含量。本研究優化工藝可為后續研究提供技術支持。

4 結論

采用響應面試驗模型能較好優化酶解法提取大高良姜多糖工藝，優化后的工藝具有操作簡單、省時高效、無毒環保等優點，提取得到的多糖有較強的抗氧化能力。

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（責任編輯 羅 麗）