油茶組培苗不定根形成過程酶的活性變化分析

陳曉明 韋璐陽 蔡玲 陳博雯 王鵬良 劉海龍

摘要：【目的】分析油茶組培苗不定根發生過程中酶的變化規律，為油茶種苗培育提供參考依據。【方法】以廣西主栽油茶無性系岑軟2號油茶、桂無1號油茶和桂普24號油茶組培苗為材料，測定其生根過程中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性。【結果】岑軟2號和桂無1號油茶組培苗易生根，培養至50 d生根率大于84.0%，而桂普24號油茶組培苗培養至50 d生根率僅52.7%，屬難生根無性系。在組培生根過程中，岑軟2號和桂無1號油茶的POD、PPO和IAAO活性在根原基誘導期均呈急劇上升的變化趨勢，在根原基形成約20 d達最高峰；桂普24號油茶的POD活性在整個生根期變化不明顯，PPO活性明顯低于岑軟2號和桂無1號油茶，IAAO活性前期不斷降低，有利于吲哚乙酸（IAA）的累積，容易形成愈傷組織。【結論】油茶組培苗生根誘導前期提高其POD、PPO和IAAO活性，有利于根原基的誘導，生根誘導后期降低其POD、PPO和IAAO活性有利于不定根伸長。生產上培育油茶組培苗時在培養基中調整外源激素和外源酚等物質的用量可提高組培苗的生根率。

關鍵詞： 油茶；組培苗；不定根；過氧化物酶；多酚氧化酶；吲哚乙酸氧化酶

中圖分類號： S794.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1344-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study change law of enzyme in the adventitious root formation of Camellia oleifera Abel. tissue-cultured plantlets， in order to provide theoretical basis for breeding C. oleifera plantlets. 【Method】Using the tissue-culture plantlets of different C. oleifera clones viz.， Cenruan 2， Guiwu 1 and Guipu 24 as materials， the activities of peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO） and indoleacetic acid oxidase（IAAO） were determined in the rooting process. 【Result】The tissue-cultured plantlets of Cenruan 2 and Guiwu 1 were easy to root， their rooting rate were more than 84.0% after being cultured for 50 days， but the rooting rate of Guipu 24 was only 52.7%， so Guipu 24 was difficult to root. The POD， PPO and IAAO activities of Cenruan 2 and Guiwu 1 showed a sharp upward trend during the root primordium induction period， and which reached up to peak about 20 days after root primordium formation. Furthermore， the POD activity of Guipu 24 didnt change significantly during the whole rooting period， which was significantly lower than those of Cenruan 2 and Guiwu 1. And IAAO activity of Guipu 24 were reduced continuously at the early stage of root primordium formation， which was beneficial to accumulation of IAA and led to callus formation. 【Conclusion】The POD， PPO and IAAO activities of C. oleifera tissue-cultured plantlets are increased at the early stage of rooting induction， which is beneficial to induction of root primordium. However， their POD， PPO and IAAO activities are decreased at the later stage of rooting induction， which is beneficial to elongation of adventitious root. Furthermore， the rooting rate of tissue-cultured plantlets is improved by adjusting dosage of exogenous hormone， exogenous phenols and so on.

Key words： Camellia oleifera Abel.； tissue culture plantlet； adventitious root； peroxidase； polyphenol oxidase； indoleacetic acid oxidase

0 引言

【研究意義】油茶（Camellia oleifera Abel.）是山茶科山茶屬植物中種子油脂含量較高且具有一定經濟栽培價值的植物總稱，主要分布于長江以南廣大區域，是我國南方重要的木本食用油料樹種（莊瑞林，2007）。茶油是我國2億多人口的主要食用油之一，油茶產業的發展已上升為國家發展戰略，國家油茶產業發展規劃也要求2009～2020年新造油茶林165萬ha（國家林業局，2009）。短期內發展如此大面積油茶人工林，良種苗木供應不足已成為影響油茶發展最關鍵的問題，而植物組織培養技術可在較短時間內培育大量遺傳穩定性好的優質種苗，是解決這一問題的有效途徑（吳幼媚等，2013），但目前油茶組培苗的生根機理尚不清楚，油茶再生體系的建立尚缺乏基礎理論支持。因此，測定分析與油茶不定根形成相關的酶活性，對我國油茶產業發展具有重要意義。【前人研究進展】油茶組培研究始于20世紀80年代，顏慕勤和陳平（1980）首次采用油茶子葉的基部誘導出胚狀體并形成了油茶再生植株，之后陸續有科技人員開展油茶組培相關技術研究并取得了一定進展。畢方鋮等（2004）以油茶優良無性系湘林4號的莖段、幼胚和子葉為外植體，王以紅等（2011）用油茶無性系岑軟3號的頂芽和莖段芽為外殖體進行組織培養，均能誘導出不定芽和不定根形成再生植株。王瑞等（2013）研究發現，可溶性糖和可溶性蛋白含量的積累是油茶扦插生根的營養基礎，過氧化物酶活性在愈傷組織形成期和不定根誘導期最高，有利于根原基的誘導。唐國濤等（2014）進行油茶組織培養生根試驗，已篩選出適合油茶生根的培養基，并利用細沙作基質獲得了較高質量的油茶生根植株。【本研究切入點】目前，很多單位開展了油茶組培育苗培養材料和培養基的篩選研究，而關于油茶組培苗不定根形成的生理生化基礎研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】在建立油茶組培再生體系的基礎上，測定分析油茶組培苗不定根形成過程中酶的變化規律，探索油茶組培苗不定根形成的調控機理，為培育油茶種苗提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為我國南方地區主栽的3個油茶無性系岑軟2號、桂無1號和桂普24號的無菌試管苗，均由廣西林業科學研究院生物研究所提供。

1. 2 試驗方法

選擇3個油茶無性系高度均約4.0 cm的繼代芽接種至同一生根培養基（1/2ER+0.5 mg/L ABT6+2.0 mg/L IAA+0.8 mg/L NAA+40.0 g/L蔗糖+4.0 g/L瓊脂）中培養，每個無性系接種60瓶，每瓶10株單芽。培養環境為：溫度（28±2）℃，光照強度2500～3500 lx，每天光照12 h。在生根培養基中培養10 d后進行第1次取樣，之后每10 d取樣1次，共取5次樣，每次每個無性系取40株生根苗，剪取長約1.0 cm莖基部分別測定過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性。POD活性采用愈創木酚法（張志良和瞿偉菁，2003）測定，PPO活性采用鄰苯二酚比色法（朱廣廉等，1990）測定，IAAO活性采用二氯酚比色法（張志良和瞿偉菁，2003）測定。

1. 3 統計分析

采用Excel 2007進行數據和圖表處理，采用SPSS 20.0進行統計分析，Duncans新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2. 1 油茶不同無性系組培苗的生根差異

油茶不同無性系組培苗在生根培養基中生根差異較明顯。其中，岑軟2號油茶在培養至25～30 d可從外觀上看到根點形成，培養至50 d大部分已生根，生根率達93.5%（表1），顯著高于其他無性系（P<0.05），根多且細長；桂無1號油茶培養至25～30 d，70.0%以上單芽長出根點，培養至50 d時大部分已生根，但根較細弱；岑軟2號和桂無1號油茶小苗基部無愈傷組織形成，不定根主要從皮部生出，屬皮部生根，為較易生根無性系；桂普24號油茶培養至20 d時，芽基部形成的愈傷組織膨大，培養至40 d時小部分苗基部在愈傷組織出現根點，培養至50 d時生根率僅52.7%，為各處理最低，生根的單芽僅有1～2條根，根系短粗且有玻璃化現象，生根過程先形成愈傷組織，之后從愈傷組織分化出不定根，屬愈傷組織生根，為較難生根無性系。

2. 2 油茶組培苗生根過程中POD活性的變化

從圖1可以看出，3個油茶無性系在組培苗不定根發生過程中，POD活性呈先升高后下降再緩慢升高的規律性變化。其中桂普24號油茶組培苗的POD活性在接種20～30 d時達最大值，但因屬芽基部形成愈傷組織，POD活性在整個生根誘導過程中變化相對平緩，變幅不大。岑軟2號和桂無1號油茶組培苗接種至生根培養基后，POD活性從接種第10 d開始迅速上升，培養至20 d時達最大值；培養至20 d后POD活性急劇下降，由此推測這兩個無性系的不定根形成前期，POD活性的上升變化趨勢即為不定根分化的標志；培養至25～30 d從苗的基部可見根點出現，組培苗進入不定根伸長期；培養至40 d后POD活性又開始緩慢上升，這時期在油茶組培苗的根部可見二級側根形成。

2. 3 油茶組培苗生根過程中PPO活性的變化

從圖2可以看出，3個油茶無性系的組培苗在整個生根誘導過程中PPO活性均呈現先上升后下降的變化趨勢。其中，岑軟2號和桂無1號油茶的PPO活性變化趨勢基本一致，從接種第10 d開始急劇上升，培養至20 d時達到峰值，峰值維持到培養30 d后快速下降；桂普24號油茶組培苗的PPO活性培養至10～30 d變幅不大，培養至30 d后才緩慢上升，在培養至40 d時達最大值，這時可看到從組培苗基部的愈傷組織處有部分根點形成。說明PPO活性升高對油茶組培苗不定根的誘導和生長有一定促進作用。從圖2還可以看出，在培養的前40 d較易生根無性系岑軟2號和桂無1號油茶組培苗的PPO活性均明顯高于較難生根無性系桂普24號油茶，表明PPO活性高低是油茶組培苗生根難易的標志之一，PPO活性高則較易生根。

2. 4 油茶組培生根過程中IAAO活性的變化

IAAO為植物體內一種含鐵的血紅蛋白，能氧化分解IAA，調節植物體內IAA的水平，進而影響植物的正常生長發育。從圖3可以看出，岑軟2號油茶組培苗的IAAO活性變化趨勢與桂無1號油茶基本一致，從培養的第10 d開始IAAO活性不斷上升，培養至20 d達最大值，這時期是兩個無性系不定根的誘導期，IAAO活性升高對油茶根原基誘導有一定的促進作用；培養至20～40 d，IAAO活性出現小幅度下降后又開始緩慢上升，培養至40 d后呈明顯下降趨勢，整個生根過程呈現上升—下降—上升—下降的變化規律。桂普24號油茶組培苗的IAAO活性在培養第10 d時明顯高于其他無性系，在培養至10～20 d時有一個緩慢下降過程，培養至20 d后IAAO活性不斷升高，培養至40 d時達峰值后開始下降，其變化趨勢為下降—升高—下降。說明易生根無性系油茶的IAAO活性變化規律與難生根無性系存在差異。

3 討論

本研究中3個無性系油茶組培苗的POD活性均呈上升—下降—上升的變化趨勢，但生根率分別為93.5%和84.2%的無性系岑軟2號和桂無1號油茶的POD活性在整個生根過程中變幅較大，而生根率較低的無性系桂普24號油茶的POD活性變幅相對平緩。吳幼媚等（2013）對油茶組培苗進行生根細胞學觀察發現，根原基在培養至16～19 d時形成，培養至25～30 d可從外觀上看到根點形成。本研究中岑軟2號和桂無1號油茶組培苗培養至25～30 d其苗的基部可見根點出現，由此推測，本研究中油茶組培苗生根培養的前20 d其POD活性升高，可能是因為產生了某些物質誘導了根原基形成，培養至20 d后其POD活性迅速下降，根原基開始形成、生長，形成不定根。這與王瑞等（2013）對油茶扦插苗的研究結果相似，即在根原基誘導期POD活性上升，不定根形成后POD活性降低，有利于根的伸長。桂普24號油茶雖然在培養的前20 d其POD活性提高，但提高幅度不明顯，體內的誘根物質濃度過低，導致僅形成愈傷組織而未進行明顯的生根分化。

本研究結果表明，岑軟2號和桂無1號油茶的PPO活性在培養初期急劇上升，在根原基形成期和生長期（生根培養至20～30 d）保持在高峰值，然后PPO活性開始下降，與宋麗紅和曹幫華（2005）對光葉楮（Broussonetia papyrifera）的研究結果基本一致。PPO活性升高不斷催化IAA與酚類物質形成生根輔助因子IAA-酚酸復合物，誘導根原基的生成，之后生根輔助因子保持在一個高濃度水平，促進不定根形成。秦永建等（2009）、王小玲等（2014）研究四倍體刺槐（Tetraploid Robinia pseudoacacia）和刺槐（R. pseudoacacia）扦插生根與PPO活性關系發現，易生根插穗的PPO活性一般高于難生根插穗，本研究也獲得了與其相似的研究結果。難生根無性系桂普24號油茶組培苗的PPO活性在整個生根期基本低于易生根的兩個油茶無性系，可能是PPO活性較低，催化形成的IAA-酚酸復合物濃度無法誘導根原基形成。

兩個易生根油茶無性系岑軟2號和桂無1號油茶組培苗在培養至20 d時其IAAO活性達最高峰，這個時期可能是因為IAAO氧化分解IAA使IAA的水平降低，有利于根原基誘導，而培養至20 d后IAAO活性下降，IAA不斷積累，有利于不定根的生長。較難生根無性系桂普24號油茶組培苗先形成愈傷組織再從愈傷組織分化出根，可能因為培養前期IAAO活性不斷降低，IAA濃度升高進而促進愈傷組織的分化。這與曹幫華等（2008）、劉玉民等（2010）研究發現高活性的IAAO使內源IAA水平降低，低含量IAA有利于生根，以及在表達期IAAO活性降低使得植株內源IAA含量升高，高含量的IAA能促進根生長的結論一致。

油茶組培苗不定根誘導、生長與POD、PPO和IAAO 3種酶活性的變化有著密切關系，而酶活性受環境條件和外源物質的影響，因此，今后在開展油茶無性系組培快繁的實踐中可根據酶活性的變化規律，通過控制環境條件和在常規油茶生根培養基中額外添加適量外源激素和外源酚等物質來影響酶活性變化，進而調控組培苗生根，提高生根率，但其調控效果還有待進一步試驗證實。

4 結論

本研究結果表明，油茶組培苗的POD、PPO和IAAO活性變化導致不同無性系的生根差異，生根誘導前期提高POD、PPO和IAAO活性，有利于根原基的誘導，生根誘導后期POD、PPO和IAAO活性降低有利于不定根伸長。因此，生產上培育油茶組培苗時在培養基中調整外源激素和外源酚等物質的用量可提高組培苗的生根率。

參考文獻：

畢方鋮，譚曉風，張智俊，陳永忠，楊偉. 2004. 油茶離體培養誘導再生植株的研究[J]. 經濟林研究，22（2）：5-9.

Bi F C，Tan X F，Zhang Z J，Chen Y Z，Yang W. 2004. Study on organogenesis and induction of regeneration plant of Camellia oleifera[J]. Nonwood Forest Research，22（2）：5-9.

曹幫華，扈紅軍，張大鵬，朱曉達. 2008. 桑樹硬枝扦插生根能力及其生根關聯酶活性的研究[J]. 蠶業科學，34（1）：96-100.

Cao B H，Hu H J，Zhang D P，Zhu X D. 2008. Rooting capacity and correlative enzymes activities of hardwood cuttings of mulberry[J]. Science of Sericulture，34（1）：96-100.

劉玉民，劉亞敏，馬明，何丙輝，李昌曉. 2010. 馬尾松扦插生根過程相關生理生化分析[J]. 林業科學，46（9）：28-33.

Liu Y M，Liu Y M，Ma M，He B H，Li C X. 2010. Analysis of relevant physiological and biochemical characteristics of Pinus massoniana during cuttings rooting[J]. Scientia Silvae Sinicae，46（9）：28-33.

秦永建，曹幫華，魏蕾，張玲，唐全，賈波. 2009. 刺槐無性系硬枝扦插生根過程中生根關聯酶活性變化[J]. 西北林學院學報，24（2）：46-49.

Qin Y J，Cao B H，Wei L，Zhang L，Tang Q，Jia B. 2009. Changes of oxidases activitiy in Black locust cuttings during rooting[J]. Journal of Northwest Forestry University，24（2）：46-49.

宋麗紅，曹幫華. 2005. 光葉楮扦插生根的吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活性變化研究[J]. 武漢植物學研究，23（4）：347-350.

Song L H，Cao B H. 2005. Studies on activities of indoleacetic acid oxidase， polyphenol oxidase and peroxidase in cuttings of Broussonetia papyrifera during rooting process[J]. Journal of Wuhan Botanical Research，23（4）：347-350.

國家林業局. 2009. 全國油茶產業發展規劃（2009-2012年）[M]. 北京：中國林業出版社.

State Forestry Administration. 2009. National Camellia Industry Development Plan（2009-2012）[M]. Beijing：China Forestry Publishing House.

唐國濤，張漢永，黃錦榮，朱昔嬌，羅萬業，邵萍，吳明芳. 2014. 油茶組織培養繁殖技術初步研究[J]. 廣東林業科技，30（3）：25-29.

Tang G T，Zhang H Y，Huang J R，Zhu X J，Luo W Y，Shao P，Wu M F. 2014. A preliminary study on tissue culture technology of Camellia oleifera[J]. Guangdong Forestry Science and Technology，30（3）：25-29.

王瑞，陳永忠，彭邵鋒，王湘南，陳隆升，羅健. 2013. 油茶扦插生根過程的生理生化基礎研究[J]. 浙江農林大學學報，30（4）：615-619.

Wang R，Chen Y Z，Peng S F，Wang X N，Chen L S，Luo J. 2013. Physiological and biochemical characteristics of Camellia oleifera during root cutting establishment[J]. Journal of Zhejiang A & F University，30（4）：615-619.

王小玲，高柱，鄭健，劉騰云，余發新. 2014. 四倍體刺槐扦插不定根發生的酶活性變化[J]. 東北林業大學學報，42 （1）： 19-22.

Wang X L，Gao Z，Zheng J，Liu T Y，Yu F X. 2014. Enzymes activity in adventitious roots formation of tetraploid Robinia pseudoacacia cuttings[J]. Journal of Northeast Forestry University，42（1）： 19-22.

王以紅，吳幼媚，蔡玲，陳博雯，黃金使. 2011. 油茶岑軟3號芽器官離體培養再生植株的研究[J]. 西部林業科學，40（4）：1-4.

Wang Y H，Wu Y M，Cai L，Chen B W，Huang J S. 2011. Study on sprout culture in vitro of Camellia oleifera Cenruan 3[J]. Journal of West China Forestry Science，40（4）：1-4.

吳幼媚，王鵬良，姚紹嫦，蔣華，蔣鋼，陳曉明. 2013. 油茶組培苗器官發生的形態學與解剖學研究[J]. 廣西植物，33（6）：745-750.

Wu Y M，Wang P L，Yao S C，Jiang H，Jiang G，Chen X M. 2013. Morphology and anatomy of organogenesis from tissue culture plantlets of Camellia oleifera[J]. Guihaia，33（6）：745-750.

顏慕勤，陳平. 1980. 油茶體細胞胚狀體的發生[J]. 實驗生物學報，3（3）：343-347.

Yan M Q，Chen P. 1980. Occurrence of somatic embryogenesis of Camellia oleifera[J]. Journal of Experimental Biology，3（3）：343-347.

張志良，瞿偉菁. 2003. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：高等教育出版社.

Zhang Z L，Qu W J. 2003. Experimental Instruction of Plant Physiology[M]. Beijing：Higher Education Press.

莊瑞林. 2007. 中國油茶[M]. 第2版. 北京：中國林業出版社.

Zhuang R L. 2007. China Camellia oleifera[M]. The 2nd Edition. Beijing：China Forestry Publishing House.

朱廣廉，鐘海文，張愛琴. 1990. 植物生理實驗[M]. 北京：北京大學出版社.

Zhu G L，Zhong H W，Zhang A Q. 1990. Principle of Plant Physiological Experiment[M]. Beijing：Beijing University Press.

（責任編輯 思利華）