5種植物乙醇提取物及其復配物對荔枝霜疫霉菌的抑菌活性

曾令達 彭惠蓮 宋冠華 王紹芬

摘要：【目的】研究5種植物乙醇提取物及其復配物對荔枝霜疫霉菌的抑菌活性，為開發荔枝水果保鮮劑和植物源復配殺菌劑提供科學依據。【方法】采用超聲波輔助提取法提取丁香、黃柏、細辛、苦參和花椒等5種植物的乙醇提取物，利用生長速率法和孢子囊萌發法探討5種植物乙醇提取物及其復配物對荔枝霜疫霉菌的抑制作用。【結果】丁香、黃柏和細辛在提取物濃度5.000 mg/mL下對荔枝霜疫霉菌的抑菌率均為100.00%，苦參和花椒的抑菌率分別為83.00%和74.00%。丁香、細辛、黃柏、苦參和花椒的乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌的抑菌中濃度（EC50）分別為0.30、0.51、0.58、1.21和1.48 mg/mL。在1∶1（V/V）的配比下，苦參與花椒乙醇提取物的復配物抑制荔枝霜疫霉菌菌絲生長的增效比率（SR）最高，為4.59，表現為增效作用；丁香+黃柏、丁香+細辛和黃柏+細辛復配物的SR則在0.5～1.5，表現為相加作用。【結論】丁香、黃柏、細辛、苦參和花椒等5種植物的乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌有較強的抑菌活性，其復配物對抑制荔枝霜疫霉菌菌絲生長具有增效或相加作用。在抑菌復配劑配伍時，可從降低成本和保護野生植物資源角度考慮選擇適當的植物種類。

關鍵詞： 乙醇提取物；復配物；荔枝霜疫霉；抑菌活性

中圖分類號： S482.38 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1332-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study antibacterial activity of ethanol extracts from 5 species of plants and their compounds against Peronophythora litchi Chen， in order to provide scientific basis for developing litchi preservatives and botanical compound fungicide. 【Method】Five kinds of extracts were extracted from Syringa aramaticum， Phellodendron amurense Rupr.， Asarum sieboldii， Sophora flavescens and Pricklyash peel by ultrasonic-assisted extraction method， respectively. The inhibitory effect of 5 kinds of extracts and their compounds on P. litchi were tested by using mycelial growth rate method and sporangial germination assay. 【Result】The results showed that， the inhibition rates of 5.000 mg/mL extracts from S. aramaticum， P. amurense and A. sieboldii against P. litchi were all 100.00%， those of extracts from S. flavescens and P. peel were 83.00% and 74.00%， respectively. The median effective concentrations（EC50） of five extracts from S. aramaticum， P. amurense， A. sieboldii， S. flavescens and P. peel were 0.30， 0.51， 0.58， 1.21 and 1.48 mg/mL， respectively. Furthermore， when any two extracts were mixed at the ratio of 1∶1（V/V）， the synergistic effect of compound extracts from S. flavescens and P. peel was the best， and the synergistic ratio（SR） was the highest（4.59）. The SR of S. aramaticum and P. amurense compound extracts， S. aramaticum and A. sieboldii compound extracts， P. amurense and A. sieboldii compound extracts ranged from 0.5 to 1.5， showing additive effect. 【Conclusion】The extracts from S. aramaticum， P. amurense， A. sieboldii， S. flavescens and P. peel have high antifungal activities to P. litchi， and their compounds have synergistic or additive inhibitory effects on mycelial growth of P. litchi. Considering compatibility of antifungal compound， the appropriate plant species should be selected from aspects of reducing cost and protecting wild plant resources.

Key words： ethanol extract； compound； Peronophythora litchi Chen； inhibitory activity

0 引言

【研究意義】荔枝霜疫霉病是荔枝最主要的病害之一，廣泛分布于我國荔枝主栽區，嚴重影響荔枝的產量（姜子德等，2011）及果實的貯藏和對外銷售，造成巨大經濟損失（戚佩坤，1994）。目前，荔枝霜疫霉病仍以化學藥劑防治為主（黃梁新，2013；曾蓉姿，2015），但瑞毒霉錳鋅、殺毒礬等常用化學藥劑的使用容易造成荔枝霜疫霉菌抗藥性提高，且頻繁用藥造成生產成本上升、環境污染、農藥殘留等后果和風險（鞠榮等，2003）。因此，研究防治荔枝霜疫霉病的高效、無公害、無殘留植物源生物藥劑對荔枝產業的健康發展具有重要意義。【前人研究進展】至今，已研究發現一些植物的提取物對荔枝霜疫霉菌具有較強的抑菌活性。吳光旭等（2006）發現開口箭甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌有明顯的離體和活體抗菌活性，對荔枝果實具有較好的貯藏保鮮效果。曾勇等（2007）發現盾葉薯蕷、水菖蒲等植物的甲醇和乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌的抑制率均在80%以上。丘麒等（2007）研究表明，巴核桃、大楊柳和甘草甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌有較高的抑菌活性。張慧等（2008）研究發現，金縷梅和毛枝魚藤等甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌具有較好的抑菌活性。羅建軍等（2012）研究發現，甘草甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌的抑制率達97.83%。曾令達等（2012a， 2012b）研究發現，陰香、大蒜、丁香、黃連和細辛等乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌具有抑制作用。將具有抑菌作用的植物提取物進行復配，可增強抑菌活性。關于防治荔枝霜疫霉的植物提取物復配研究也進行了一些嘗試，但相關報道很少，且主要為提取物與化學殺菌劑之間的復配。賴毅東（2003）篩選出增效作用較好的中草藥配伍液PW-6，該配伍液對荔枝霜疫霉菌有很強的抑制作用；胡美英等（2009）發現茶皂素與咪鮮胺混合對自然傷口感染霜疫霉的荔枝果30 d防效可達95.23%。【本研究切入點】目前，關于植物提取物對荔枝霜疫霉抑制效果的研究主要在單一植物提取物方面，對不同植物提取物協同抑菌的研究較少。【擬解決的關鍵問題】在篩選較強抑菌活性植物的基礎上，采用離體培養方法進行單一植物乙醇提取物和復配物對荔枝霜疫霉菌抑菌活性試驗，明確單一植物乙醇提取物和復配物的抑菌活性差異，旨在為開發高效、經濟的荔枝水果保鮮劑和植物源復配殺菌劑提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試植物材料共4科5種（表1），均從惠州市惠城區大參林藥店購進。供試荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchi Chen）由惠州學院生命科學系生理實驗室提供。

1. 2 植物提取物制備

將植物晾干后粉碎過40目篩，稱取50.0 g置于500 mL三角瓶中，加入95%乙醇100 mL浸泡5 h，超聲波提取1 h后過濾，再用95%乙醇定容至100 mL，置于-4 ℃冰箱保存備用。

1. 3 抑菌活性試驗

1. 3. 1 菌絲生長速率法 分別將5種植物提取物與 PSA培養基（馬鈴薯蔗糖培養基，冷卻至50 ℃左右）充分混合，配制成5.000 mg/mL帶藥培養基，進行菌絲生長量測定；另外，將丁香、細辛和黃柏提取物配制成2.000、1.000、0.500、0.250和0.125 mg/mL等5個質量濃度梯度的帶藥培養基，把苦參和花椒提取物配制成5.000、2.500、1.000、0.500和0.250 mg/mL等5個質量濃度梯度的帶藥培養基，進行同一植物提取物在不同濃度梯度下菌絲生長量測定。取10 mL各帶藥培養基倒入直徑為9 cm的培養皿制成帶藥培養基，用直徑為4 mm的打孔器在培養好的荔枝霜疫霉菌落邊緣打取菌餅，將菌餅移植到帶藥培養基中心（一皿一個菌餅），使菌絲面向下接觸培養基，28 ℃培養5 d后，用十字交叉法測量并記錄菌落直徑，按下述公式計算抑菌率。以乙醇代替提取物制作培養基為對照，每處理3次重復。

菌絲凈生長量=菌落直徑-菌餅直徑

抑菌率（%）=（對照菌絲凈生長量-處理菌絲凈生長量）/對照菌絲凈生長量×100

毒力計算方法：將抑菌率換算成幾率值，質量濃度以對數值表示，以各提取物不同質量濃度的對數值（x）和菌落生長抑制率的幾率值（y）求取毒力回歸方程y=a+bx，并計算抑菌中濃度（EC50）。

1. 3. 2 孢子囊萌發法 將荔枝霜疫霉菌接種于PSA培養基上28 ℃下培養10 d后，用20 mL無菌蒸餾水沖洗菌絲及孢子囊，4層紗布過濾制得孢子囊懸液，鏡檢并調整孢子囊濃度，使其在低倍鏡下（10×10）每個視野的孢子數達80～100個。取5 mL孢子囊懸液于試管中，加入5.000 mg/mL植物提取物后放入28 ℃恒溫振蕩培養箱中培養5 h后鏡檢，隨機檢查3個視野，統計孢子萌發數，按下述公式計算孢子囊萌發抑制率。每處理重復3次，以95%乙醇加入孢子囊懸液作對照。

孢子囊萌發抑制率（%）=（對照孢子囊萌發率-處理孢子囊萌發率）/對照孢子囊萌發率×100

1. 4 復配物抑菌效果試驗

參照Wadley的方法（王廷廷，2013）進行植物乙醇提取物的復配試驗。復配方法：用制備的提取物母液在1∶1（V/V）配比下混合，混合后以兩種提取物的EC50為基礎，用二倍稀釋法配制復配物梯度，根據濃度梯度的實測值通過毒力回歸方程計算EC50實測值，并通過下述公式計算理論EC50。

復配物理論EC50=（a+b）/[（a/A的EC50）+（b/B的EC50）]

式中，A、B分別代表不同植物提取物，a、b分別為兩組分在混劑中含量的比值。

以增效比值（SR）判定不同混合組配的抑菌活性作用，SR<0.5為拮抗作用，SR=0.5～1.5為相加作用，SR>l.5為增效作用。

增效比值（SR）=EC50理論值/EC50實際值

2 結果與分析

2. 1 不同植物乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長的抑制作用

如表2所示，在5.000 mg/mL濃度下，丁香、黃柏和細辛對荔枝霜疫霉菌的抑菌率均為100.00%，苦參和花椒的抑菌率分別為83.00%和74.00%。如表3所示，在2.000 mg/mL濃度下，丁香、黃柏和細辛對荔枝霜疫霉菌的抑菌率分別為97.36%、80.99%和92.28%，顯示丁香、黃柏和細辛較苦參和花椒對荔枝霜疫霉有更強的抑制作用。根據5種植物提取物的5個濃度梯度對荔枝霜疫霉菌的抑菌率分別計算各提取物的毒力回歸方程；根據回歸方程，得到各乙醇提取物的EC50（表3）。從表3的EC50可看出，對荔枝霜疫霉菌抑菌活性最強的為丁香，其后依次是細辛、黃柏、苦參和花椒。

2. 2 不同植物乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發的抑制作用

由表4可知，分別用濃度為5.000 mg/mL的植物乙醇提取液處理荔枝霜疫霉菌孢子囊，以花椒乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發的抑制率最高，為80.45%，黃柏、細辛、丁香和苦參的抑制率均在50.00%以上，分別為73.73%、57.65%、78.36%和58.90%，細辛乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌孢子囊的抑制率最低。

2. 3 不同植物乙醇提取物的復配物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長的抑制作用

依椐上述不同植物提取物的抑菌效果，選取丁香、黃柏和細辛進行兩兩復配，苦參與花椒進行復配。如表5所示，在1∶1（V/V）的配比下，植物乙醇提取物復配后形成苦參+花椒、丁香+黃柏、丁香+細辛和黃柏+細辛4種復配物，對應的EC50分別為0.29、0.45、0.30和0.52 mg/mL。由表6可知，苦參+花椒復配物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長有較強的抑制作用，SR為4.59，表現為增效作用；丁香+黃柏、丁香+細辛和黃柏+細辛復配物的SR分別為0.89、1.23和1.04，表現為相加作用。

3 討論

自然界中擁有非常豐富的荔枝霜疫霉生物防治資源（徐遲默等，2015），但不同植物的乙醇提取物的抑菌效果不同（謝俊杰等，2016）。本研究發現在乙醇提取物濃度5.000 mg/mL條件下，丁香、黃柏、細辛、苦參和花椒對荔枝霜疫霉菌的抑菌率均大于70.00%。在植物抑菌研究中，佘世望等（1997）測定了60種植物乙醇提取物的抗菌防腐作用，發現丁香、花椒等5種中藥對19種食品腐敗菌有明顯的抗菌作用，其中丁香和花椒具有較強的抑菌作用。本研究同樣發現丁香和花椒具有較強的抑菌活性，丁香和花椒對荔枝霜疫霉菌的EC50分別為0.30和1.48 mg/mL；在5.000 mg/mL條件下，丁香、花椒對荔枝霜疫霉的抑菌率分別為100.00%和74.00%，對荔枝霜疫霉孢子囊的萌發抑制率分別為78.36%和80.45%。黃柏具有廣泛的抗菌作用，都日娜和烏日娜（2008）研究發現黃柏在抗炎、抗菌方面有廣泛作用，有良好的開發前景；王蘭等（2010）發現黃柏、苦參等中藥對黑曲霉、擬青霉等真菌有明顯的抑霉作用；陳潔等（2013）在進行傳統中藥體外抗真菌研究中發現，黃柏、知母等具有較好的抗真菌活性。本研究發現黃柏對荔枝霜疫霉也具有較強的抑制作用，黃柏對荔枝霜疫霉的EC50為0.58 mg/mL，在5.000 mg/mL條件下，黃柏對荔枝霜疫霉的抑菌率為100.00%，對荔枝霜疫霉孢子囊的萌發抑制率為73.73%。曾勇等（2007）用10 mg/mL苦參甲醇提取物處理荔枝霜疫霉菌，其對菌絲的生長抑制率為89.10%，具有較強的抑菌活性；本研究中苦參乙醇提取物在5.000 mg/mL條件下對荔枝霜疫霉的抑菌率為83.00%，兩者試驗結果較一致。細辛為常用傳統中藥，活性成分復雜，不僅具有廣泛的藥理作用，還具有抗農業害蟲和抗植物霉菌病害等作用（韓俊艷等，2011）。本研究中細辛對荔枝霜疫霉具有較強的抑菌活性，其對荔枝霜疫霉的EC50為0.51 mg/mL，在5.000 mg/mL條件下，細辛對荔枝霜疫霉的抑菌率為100.00%，對荔枝霜疫霉孢子囊的萌發抑制率為57.65%。另外，本研究發現在5.000 mg/mL條件下，花椒乙醇提取物對荔枝霜疫霉孢子囊萌發的抑制作用較強，細辛和苦參乙醇提取物的抑制率較低，但所有供試植物乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌的抑制率均超過50.00%，顯示這5種植物乙醇提取物具有較高的抑菌活性。而乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長和孢子囊萌發的抑制率無一致性，可能與抑菌物質的作用位點和作用機理不同有關。

不同的抑菌物質，由于其化學組成和結構不同而具有不同的性質，當不同物質同時存在時，常因相互之間的作用和影響而使其性質發生不同程度改變。由于植物提取物的復配活性和作用機理非常復雜，復配效果必然是各種活性成分相互間作用的綜合結果，因此，提取物的復配是否得當，直接影響殺菌劑的藥效。含有丁香、苦參等乙醇提取物的殺菌復配劑具有較好的殺菌效果。韓相鵬等（2003）研究表明，苦參素與2%新科高濃縮殺蟲劑混合可有效控制黃芪根病危害；方哲等（2009）研究發現，丁香與苦參提取液復配對人參銹腐病菌的孢子萌發有很強的抑制作用，對病原菌菌絲生長有抑制作用；焦鐳等（2011）進行了15種中草藥及復配液的抑菌性和穩定性研究，結果表明，復配液PW4（丁香、厚樸、苦參）、PW7（紫丹參、厚樸、苦參）和PW10（厚樸、苦參、迷迭香）是其中效果較好的配伍；在荔枝霜疫霉的防治研究中，賴毅東（2003）篩選出含有丁香的配液PW-6增效最佳，對荔枝霜疫霜的最小抑菌濃度（MIC）為3.125 mg/mL。本研究將5種植物乙醇提取物進行復配，發現在1∶1（V/V）的配比下，苦參+花椒復配物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長有較強的抑制作用，表現為增效作用；丁香+黃柏、丁香+細辛和黃柏+細辛復配物表現為相加作用。因此，在抑菌復配劑配伍時，應從降低復配抑菌劑成本和保護野生植物資源的角度考慮選擇適當的植物種類，但本研究中有關乙醇提取物和復配物對荔枝霜疫霉菌的作用部位和代謝影響等機理尚有待進一步研究。

4 結論

丁香、黃柏、細辛、苦參和花椒等5種植物的乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌有較強的抑菌活性，苦參與花椒的乙醇提取物復配物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長具有抑制增效作用，丁香+黃柏、丁香+細辛和黃柏+細辛等乙醇提取物復配物具有相加作用。在抑菌復配劑配伍時，可從降低成本和保護野生植物資源角度考慮選擇適當的植物種類。

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（責任編輯 麻小燕）