同源重組與Gibson Assembly方法構建腺病毒載體*

鄧楚鐘, 潘耀振

(貴州醫科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽　550001)

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同源重組與Gibson Assembly方法構建腺病毒載體*

鄧楚鐘, 潘耀振*

(貴州醫科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽550001)

[摘要]目的： 對比同源重組與Gibson Assembly兩種方法構建腺病毒載體的效率。方法： 增殖并提取AD4 DNA，分別用同源重組與Gibson Assembly兩種方法，將AD4 DNA鑲嵌入pBR322質粒，構建出攜帶有全長AD4 DNA的腺病毒載體，并進行PCR和測序鑒定，對比兩種方法構建腺病毒載體的篩選效率。結果： 兩種方法均能構建出正確的腺病毒載體；篩選同源重組法1 000個菌落中，鑒定360個，僅有1個菌落；Gibson Assembly法112個菌落數中，鑒定其中10個，有3個陽性。結論： Gibson Assembly方法比傳統同源重組方法在構建腺病毒載體時更有效。

[關鍵詞]腺病毒； 疫苗； 重組載體； Gibson Assembly

腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，分子量為150 MDa，直徑約為950 ?，它是已知最大和最復雜的無包膜DNA病毒之一[1]。腺病毒廣泛存在于自然中，能通過呼吸道、消化道、眼黏膜等途徑感染動物和人，無論增殖和非增殖細胞均可以被感染，但對人類的致病性低。由于腺病毒和人類基因組同源，感染后不會整合到人染色體中，不會導致染色體突變。因此，將腺病毒作為抗原呈遞載體構建疫苗，具有高效、安全、給藥方便的優點，可以激發機體天然免疫反應，同時便于保存及成本易控[2-9]，這些優勢使得腺病毒載體成為疫苗研究的熱點。同源重組方法構建腺病毒載體是目前公認的效率較高的方法，但由于受到36 Kd腺病毒DNA堿基數量過大影響，實際效率不高。Gibson Assembly方法是近些年由Dr. Daniel Gibson發明了一種新的方法，可以容易的將多個線性DNA片段組合到一起。本研究采用傳統同源重組與Gibson Assembly兩種方法對腺病毒載體進行構建，并做出對比與評價。

1材料和方法

1.1主要材料

質粒pBR322、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌DY330、E1區、E3區、蛋白IX缺損的4型腺病毒以及Hela229細胞由中國軍事醫學科學院8所提供，經PCR及酶切鑒定無誤。質粒提取試劑購買于威格拉斯公司，電擊儀、1 mL電擊杯購于Bio-Rad Micro pulserTM公司，Gibson Assembly Mix試劑購買于NEB公司，Q5 Taq酶購買于NEB公司，限制性內切酶購買于寶生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1腺病毒感染繁殖和DNA提取E1區、E3區、蛋白IX缺損的Ad4感染入Hela229細胞， 10%胎牛血清 EMEM 37 ℃溫箱培養72 h，使病毒在細胞內增殖。反復凍融數次，破壞細胞壁后收集至20 mL超濾管5 000 g離心30 min，使含有病毒的培養液濃縮。加入Baffer A 2 mL(100 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、12.5 mmol/L EDTA)到20 mL超濾管5 000 g離心，反復洗滌4次后加入等體積Baffer B(100 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、12.5 mmol/L EDTA、2%SDS)及1/50體積蛋白酶K，50 ℃反應30 min。酚氯仿抽提及乙醇沉淀得到純凈的DNA。-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2同源重組方法構建腺病毒載體

1.2.2.1腺病毒載體質粒骨架(pBR-4VLR)構建pBR322質粒用限制性內切酶HindIII切成線性。用PCR擴增兩條同源壁，一端(40 bp)與pBR322同源，另一端與AD4兩端同源。左臂長974 bp，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTG，下游引物GACGAGCAGGCGATTCAGAAC；右臂長853 bp，上游引物GCCTCAGGAACAACGATGGAA，下游引物CACAAAAAAAATAAGGTATATTATTGATGA。在DY330中同源重組，使同源臂鏈接在pBR322上。

1.2.2.2打靶感受態制備取5 μL DY330細胞接于5 mL無抗性培養液中，30 ℃搖床增殖12～16 h。取增殖后的菌液300 μL加入15 mL LB，30 ℃搖床培養2 h，42 ℃水浴搖床培養12 min，冰浴30 min，用離心機7 500 r/min和無菌水在4 ℃條件下洗滌3次。10%甘油重懸1 mL，4 ℃ 12 000 r/min離心機中再洗滌1次， 10%甘油200 μL重懸。

1.2.2.3同源重組取40μL感受態細胞、AD4 DNA10 ng和pBR-4VLR 1.5 ng于電擊杯中，電擊儀電擊。電擊打靶條件:電壓1.5 kV，電阻300 Ω，電容2.5 μF。加入無抗LB1 mL稀釋，取出500 μL涂瓊脂平板，置入30 ℃溫箱培養過夜，挑平板中單菌落作鑒定。見圖1。

圖1　同源重組法構建腺病毒載體方法Fig.1　Illustration of homologous recombination in constructing adenovirus vector

1.2.3Gibson Assembly方法構建腺病毒載體1.2.3.1原料擴增pBR322為載體骨架，將3.6 kb的AD4 DNA分成AD-1、AD-2、AD-3、AD-4 4段，均用PCR方法擴增，5段原料兩側均設計30 bp左右的同源臂。pBR 322段(2 kb)：Q5Taq，上游引物ATTATTGATGATGCGATCGCCATCGGTATCATTACCCCCATG，下游引物TATATTATTGATGATGCGATCGCGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCC；條件為98 ℃預變性 5 min，98 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min, 3個循環; 98 ℃ 10 s、72 ℃ 1 min, 27個循環; 最后 72 ℃延伸2 min。PCR 產物膠回收純化。AD-1段(8.6kb)：Q5Taq，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTGTGAGTTAATATGC，下游引物TGAGTTTGAACCTGAAAGACAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATC。AD-2段(10 kb)DNA模板AD4 DNA，Q5酶，上游引物ATTGACGGCGGCCTGCCGCAGAATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTG，下游引TGCCTAACAGACCCAACTACATTGGCTTCAGAGACAATTTTATCGG。AD-3段(10 kb)DNA模板AD4 DNA，Q5Taq，上游引物GCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCG，下游引物TTAGTGATTCTGAGGGGTATTATACCCAACATACTTTTATCT。AD-4段(7.4 kb)DNA模板AD4 DNA，Q5Taq，上游引物ATGACATTAAGGTCATACCATTGCCAACACCCAGCCCACCTAGCA，下游引物TTGCATATTAACTCACACAAAAAAAATAAGGTATATTATATAGATAG。條件為98 ℃預變性3 min; 98 ℃ 10 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 4 min, 30個循環; 72 ℃延伸2 min。PCR 產物膠回收純化。

1.2.3.2PCR產物鏈接在充分預冷前提下，快速以每種產物0.2～1 pmol/L濃度配備好溶液，再加無菌水至10 mL,并加入Gibson Assembly Mix酶10 μL，50 ℃反應60 min，電擊轉化法轉入DH5α。置入37 ℃溫箱培養過夜。挑平板中單菌落作鑒定。見圖2。

圖2　Gibson Assembly方法構建腺病毒載體方法Fig.2　Illustration of Gibson Assembly method in constructing adenovirus vector

2結果

2.1AD4 DNA制備

AD4感染Hela229細胞24 h后，顯微鏡下觀察見細胞變形、萎縮、凋亡，見圖3，轉染效率達到80%以上。用超濾管濃縮后提取，可以從>20 mL的Ad4上清中提取DNA，產物濃度600～800 mg/L，產物體積每管20 μL。經NotI、EcoRV、EcoRI、KpnIBamHI、HindIII、SmaI、XbaI酶切定酶切鑒定，證實DNA序列沒有出現大量斷裂和損傷,見圖4。

圖3　Ad4病毒培養(Hela229)Fig.3　Cultivation of Ad4 virus

2.2腺病毒載體鑒定

PCR鑒定，擴增片段大小為750 bp(圖5)，同源重組及Gibson Assembly方法測序鑒定見圖6，結果正確。

圖4　NotI、EcoRV、EcoRI、KpnI BamHI、HindIII、SmaI、XbaI酶切鑒定Fig.4　Enzyme digestion of AD4 DNA by NotI,EcoRV,EcoRI, KpnI BamHI, HindIII, SmaI, XbaI

注：載體1為同源重組法，載體2為Gibson Assembly法圖5　PCR鑒定同源重組與Gibson Assembly方法構建的腺病毒載體Fig.5　PCR identification of homologous recombination and Gibson Assembly method

注：A為同源重組法，B為Gibson Assembly法圖6　同源重組及Gibson Assembly方法構建的腺病毒載體測序結果Fig.6　Sequence outcome of homologous recombination and Gibson Assembly method

2.3篩選效率

如表1所示，同源重組方法的篩選效率低于Gibson Assembly方法。

表1　同源重組方法與Gibson Assembly方法

3討論

基因治療是近幾十年來發展起來的一種治療疾病的手段,已經成功地應用于臨床[10]。它通過基因的轉移來預防和治療疾病,尤其在疫苗、腫瘤及遺傳性疾病方面, 應用前景十分突出。基因治療中,基因傳遞系統是研究的重點，如何把特異性基因快速、高效的導入相應的靶細胞，不僅是研究特定基因的結構、功能及表達調控的重要手段,也是基因治療的關鍵[11]。基因傳遞系統中應用的載體分為非病毒方式和病毒方式[12]。非病毒方式載體在基因治療中應用較少，它的優點在于沒有病毒的致病性,因此機體不會導致明顯的免疫反應,相對安全 ,缺點在于目的DNA轉染效率低,即使轉入細胞內，也容易被細胞內DNA酶降解,導致為數不多的目的基因無法穩定存在于細胞內并高效表達。目前，絕大多數的基因治療的方案中都使用病毒載體介導目的基因，主要優點是轉染效率高,目的基因表達穩定；病毒載體可剪除一些致病基因序列，改造成低致病性的缺陷型病毒，使得用病毒載體的基因治療更加安全。用于基因治療的常用載體有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體 、腺病毒相關病毒載體 、單純皰疹病毒載體以及嵌合病毒載體等[13]。

腺病毒載體構建完成，只需將目的基因插入到病毒基因組中預先缺損的E1區、E3區、蛋白IX三個區域，感染到細胞內，就可使用能表達目的基因的重組腺病毒制成的藥物，發揮作用。如插入CTB(霍亂弧菌腸毒素的B亞基)，構建出霍亂疫苗，插入HBsAg(乙肝病毒表面抗原)構建出乙肝疫苗。具體效果取決于抗原類型和插入的區域。從目前臨床應用來看，由正常人p53腫瘤抑制基因和改構的5型腺病毒基因重組而成的世界上第一個上市的腫瘤基因治療藥物，即重組人p53腺病毒注射液(國藥準字S20040004)已于2012年在中國生產[14]。重組人p53腺病毒中p53基因是發揮腫瘤治療作用的主體結構，腺病毒為載體，腺病毒載體承載p53治療基因進入腫瘤細胞內發揮作用。實踐證實腺病毒載體承載基因效果明顯，而且相對其它手段還具有安全、給藥方便等特點。可用于制藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領域，有很高的科研和臨床應用價值，前景非常寬廣。

同源重組方法是目前使用很多的方法，它是基于pBR322通過PCR引物在質粒的兩端加上同源臂構建出質粒骨架pBR-4VLR，利用DY330的Red重組酶(由Gam、Bet、Exo 3個亞基組成)，使E1區、E3區、蛋白IX缺損的線性的AD4 DNA在大腸桿菌內與質粒發生序列特異的發生同源重組，制作成腺病毒載體。同源重組法利用Red重組酶，能快速、精確的將AD4 DNA引入質粒骨架中，但篩選時易出現出現假陽性結果，背景值很高。考慮原因為腺病毒DNA序列較長，使質粒骨架對其捕捉時效率降低。

Gibson Assembly方法不用考慮片段的長度或者末端的互補性，將多個具有重合區的DNA片段放在一個單溫反應管里就可以實現片段的連接。在T5外切酶、Phusion DNA聚合酶、Taq DAN連接酶的作用下，用PCR擴增的5段DNA片段連接成一個完全的雙鏈DNA分子，制作成相同的腺病毒載體。制作中不僅減少了同源重組方法中的很多工序，降低了操作難度還節約時間。腺病毒載體的鑒定中，只有較少菌落，并且很容易就得到了正確的菌落。最重要的是同源重組等方法構建出腺病毒載體后需要將目的基因采用雙質粒共轉染等方法插入腺病毒載體中，而 Gibson Assembly方法則只需將目的基因和其它DNA片段一起用PCR擴增出來，再共同一管反應，直接連接在一起。非常高效、靈活。

從載體篩選來說，同源重組的假陽性結果非常多，背景值較高，篩選很困難。而Gibson Assembly方法讓我們獲得了滿意的效率。從載體的構建方面看Gibson Assembly方法明顯比傳統的同源重組更加簡單、快捷和方便，由于可以將多條DNA片段同時連接，Gibson Assembly更加靈活多變。Gibson Assembly這種新方法的簡單、高效、多變，在腺病毒載體構建方面表現出了非常好的前景。本實驗針對腺病毒疫苗載體構建方法做了構想、設計、實際操作、對比及評論，利用目前應用最多的同源重組方法和近年來開發但并未應用于腺病毒載體構建中的Gibson Assembly方法進行實際操作、評估，得到了Gibson Assembly方法相比其他方法更具優勢的理論和數據支持。希望能為此領域的研究提供依據，為下一步的研究和改進工作提供數據和經驗。

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(2016-01-05收稿，2016-03-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Comparison between Homologous Recombination and Gibson Assembly Method in Constructing Adenovirus Vectors

DENG Chuzhong, PAN Yaozhen

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To compare the efficiency of traditional homologous recombination method with Gibson Assembly method in constructing adenovirus vector. Methods: AD4 DNA was proliferated and extracted, and inlaid AD4 into the pBR322 DNA plasmid and constructed adenovirus vector with total length of the AD4 DNA by homologous recombination method or Gibson Assembly method, which was amplified by PCR and sequenced for identification. Then, the efficiency of two methods was compared. Results: Both methods could construct the adenovirus vector of right sequence. There were over 1 000 colonies in the plate using homologous recombination method, among which 360 colonies were identified and there was only one positive result. Although there were only 112 colonies in the plate using Gibson Assembly, 10 colonies among then were identified and there were three positive results. Conclusion: Gibson Assembly method is more efficient than traditional homologous recombination method in constructing adenovirus vector.

[Key words]adenovirus; vaccine; recombination vector; Gibson Assembly

[中圖分類號]R346

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0430-06

*通信作者E-mail:527089839@qq.com

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1825.032.html