柴胡疏肝散對抑郁大鼠海馬微管相關蛋白-2磷酸化的影響*

劉繼剛， 袁　楊， 臧　蔚， 劉　昊**

(1.遵化市人民醫院 口腔科， 河北 遵化　064200； 2.華北理工大學附屬醫院 神經內科， 河北 唐山　063000)

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·基礎研究·

柴胡疏肝散對抑郁大鼠海馬微管相關蛋白-2磷酸化的影響*

劉繼剛1， 袁楊2， 臧蔚2， 劉昊2**

(1.遵化市人民醫院 口腔科， 河北 遵化064200； 2.華北理工大學附屬醫院 神經內科， 河北 唐山063000)

[摘要]目的： 探討柴胡疏肝散對抑郁大鼠海馬組織微管相關蛋白-2(MAP-2)磷酸化的影響。方法： 成年雄性Wistar大鼠45只，隨機均分為對照組、模型組和治療組；模型組和治療組采用慢性不可預性溫和應激建立抑郁癥大鼠模型，治療組同時經灌胃給予柴胡疏肝散治療，持續22 d；采用糖水實驗、高架十字迷宮實驗和Morris水迷宮實驗觀察各組大鼠行為學變化，Western blot方法檢測各組大鼠海馬組織MAP-2及磷酸化MAP-2(pMAP-2)表達，Real-time PCR檢測pMAP-2 mRNA表達。結果： 與對照組比較，模型組大鼠糖水偏好百分比明顯降低，進入開臂次數和停留時間百分比增高，水迷宮逃避潛伏期延長，海馬pMAP-2蛋白和mRNA表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠糖水偏好百分比明顯增高，進入開臂次數和停留時間百分比降低，水迷宮逃避潛伏期減少，海馬pMAP-2蛋白和mRNA表達水平明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論： 柴胡疏肝散具有顯著的抗抑郁作用，該作用可能與影響海馬MAP-2磷酸化有關。

[關鍵詞]柴胡疏肝散； 抑郁癥； 海馬； 微管相關蛋白； 大鼠，wistar

反復的應激是導致抑郁癥(depression)發生的根本原因，其核心癥狀是興趣感缺失、記憶力減退等，抑郁癥發病率高，社會危害較大。大量研究表明，海馬神經元體積萎縮，特別是微管相關蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP-2)的變化可能是抑郁癥重要的病理生理過程[1-2]。中醫認為抑郁癥是由于情志不舒，肝氣郁結所致，多采用疏肝理氣法對其進行治療[3]。柴胡疏肝散是中醫臨床上治療肝郁證的常用方劑，能明顯改善抑郁癥的臨床癥狀，但其具體機理尚不清楚[4]。本研究建立抑郁癥大鼠模型，觀察柴胡疏肝散對大鼠行為學和海馬組織MAP-2磷酸化的影響，探討柴胡疏肝散抗抑郁作用機理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性Wistar大鼠45只，2月齡，體重180～210 g，清潔級，由華北理工大學實驗動物中心提供(SCXK京2009-0004動物合格證號)。常規適應性飼養1周后用于實驗，飼養條件室溫18～28 ℃，濕度60%～80%。

1.1.2藥品與試劑兔抗鼠MAP-2、兔抗鼠pMAP-2抗體購自Santz Cruz公司，Western blot相關試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒購自Takara公司。柴胡疏肝散飲片由河北省中藥材公司提供，飲片按照柴胡6 g，白芍4.5 g，枳殼4.5 g，川芎4.5 g，醋炒陳皮6 g，香附4.5 g，炙甘草1.5 g組方。將各味藥清水浸泡1 h，砂鍋煎煮至沸后至少20 min，使其終濃度為每毫升藥液含原生藥1 g。

1.2方法

1.2.1分組將大鼠隨機分為對照組、模型組和治療組，每組15只。按文獻[4]方法給予大鼠慢性不可預見性溫和應激(CUMS)制作抑郁癥大鼠模型。治療組在造模同時，給予大鼠柴胡舒肝散，每日灌胃1次(每毫升藥液含原生藥1 g，劑量1 mL/100 g體質量)，其他兩組給予等體積生理鹽水。造模及給藥持續22 d，結束后24 h處死大鼠。對照組不作特殊處理。

1.2.2糖水偏好實驗實驗前禁止飲水2.5 h，實驗時分別用10%蔗糖水和自來水給大鼠供飲，測量大鼠1 h內的蔗糖水和自來水消耗量，計算糖水偏好百分比(糖水消耗量/總液體消耗×100%)。

1.2.3高架十字迷宮實驗分別將3組大鼠置于高架十字迷宮中央區，頭朝開臂。通過動物行為視頻分析系統記錄分析5 min內大鼠的活動情況。檢測大鼠進入開臂次數百分比和在開臂滯留時間百分比。

1.2.4Morris水迷宮實驗每組取5只大鼠，利用鼠博士行為學分析系統進行定位航行實驗，記錄大鼠60 s內找到水下平臺的時間(逃避潛伏期)。

1.2.5MAP-2和pMAP-2表達Western blot檢測海馬MAP-2和pMAP-2表達。每組各取大鼠5只，麻醉后斷頭取腦，快速分離海馬，提取組織總蛋白，按照30 μg蛋白量上樣， 10% SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉印，脫脂奶粉封閉，MAP-2一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，同樣方法進行pMAP-2和內參照β-actin的SDS-PAGE電泳和顯色。以目的條帶與內參照的光密度比值表示蛋白相對表達。

1.2.6pMAP-2 mRNA表達Real-time PCR檢測pMAP-2 mRNA表達。每組大鼠各取5只，麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬組織，提取總RAN。定量后取1 μg總RNA，按照試劑盒說明書進行反轉錄和PCR 擴增。pMAP mRNA引物序列：sense 5′-TGG CTT TCT CAT CTC CAT CC-3′，antisense 5′-CTC ACT GCC CCA TTA GTG C-3′，產物大小357 bp。管家基因β-actin引物序列：sense5′-CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG-3′，antisense 5′-TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA-3′，產物大小389 bp。PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s(35個循環)。按照公式ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)、ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)計算2-ΔΔC t(代表pMAP-2 mRNA水平)。

1.3統計學處理

2結果

2.1行為學實驗

糖水偏好實驗結果表明，模型組糖水偏好百分比明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組低于對照組，但高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。高架十字迷宮實驗顯示，模型組大鼠進入開臂次數百分比和在開臂停留時間百分比明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組低于對照組，高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。Morris水迷宮實驗結果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組高于對照組，低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組大鼠行為學檢測結果

(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.2海馬組織MAP-2和pMAP-2蛋白表達

Western blot結果表明，模型組大鼠海馬組織pMAP-2與MAP-2比值明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組低于對照組，高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1　海馬MAP-2和pMAP-2表達(Western blot)Fig.1　Expressions of MAP-2 and pMAP-2 in hippocampus tissue detected by Western blot

組別pMAP-2MAP-2pMAP-2/MAP-2對照組0.94±0.11 1.05±0.120.90模型組0.18±0.02(1)1.18±0.200.15(1)治療組0.43±0.05(1)(2)0.71±0.08(1)(2)0.61(1)(2)

(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.3海馬組織pMAP-2 mRNA表達

Real-time PCR結果表明，模型組大鼠海馬pMAP-2 mRNA相對表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組低于對照組，高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與對照組比較,P<0.05；(2)與模型組比較,P<0.05圖2　3組大鼠海馬組織pMAP-2 mRNA表達(Real-time PCR)Fig.2　Expressions of MAP-2 and pMAP-2 in hippocampus tissue detected by Real-time PCR

3討論

當今社會，隨著生活壓力的增加，抑郁癥發病率有增高趨勢[5]。但由于抑郁癥確切發病機制尚未明確，因此對抑郁癥的治療尚缺乏有效的根治方案。中醫認為抑郁癥是由于情志不舒，肝氣郁結所致，中醫藥對抑郁癥的療效也逐漸得到人們的認可。中醫還認為，抑郁癥屬“郁證”范疇，是情志不舒，肝氣郁結，漸致五臟不和，化火、生痰、瘀阻、耗氣、傷陰等而致。根據中醫對癥治療原則，中醫臨床上多采用疏肝理氣法對抑郁癥進行治療，常用方劑之一是柴胡疏肝散[3]。柴胡疏肝散由柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、炙甘草等7味藥組成，能發揮疏肝解郁、行氣止痛作用，主治肝氣郁滯諸癥。中醫臨床研究表明，柴胡疏肝散對肝郁氣滯、氣血不合之證多有效驗[6-8]。

本研究首先檢測了柴胡疏肝散對大鼠行為學的影響。結果顯示，與模型組比較，經過柴胡疏肝散治療后，大鼠糖水偏好百分比、高架十字迷宮開臂次數百分比及開臂時間百分比明顯升高，Morris水迷宮逃避潛伏期顯著降低，提示柴胡舒肝散能明顯減輕抑郁癥大鼠的興趣感缺失、焦慮癥狀、記憶力減退等臨床癥狀，對抑郁癥大鼠具有較明顯的治療作用。MAP，即微管相關蛋白，能調節細胞骨架微管的聚合與解離狀態，在維持神經元形態和突觸可塑性方面發揮重要作用[9-10]。隨著影像技術的發展，對抑郁癥患者腦結構改變的研究取得顯著進展，能直接觀察到抑郁癥患者存在海馬部位結構與功能異常[11]。同樣的研究結果在動物實驗中也得到驗證[12]。為進一步探討柴胡疏肝散的作用機理，本研究進一步檢測了大鼠海馬MAP-2及其磷酸化的改變。結果表明抑郁癥大鼠海馬組織中pMAP-2與MAP-2比值顯著降低，提示MAP-2蛋白磷酸化增強可能是抑郁癥發病的一個重要環節。這與隋竹欣等的研究結果相一致[2]。課題組進一步研究發現，抑郁癥大鼠經過柴胡疏肝散治療后，MAP-2蛋白磷酸化降低現象得到顯著逆轉，pMAP-2與MAP-2比值明顯高于模型組，但仍低于對照組(P<0.05)。mRNA水平檢測結果與蛋白質結果相一致。綜合實驗結果提示，柴胡疏肝散能影響抑郁癥海馬組織MAP-2磷酸化，這可能是其抗抑郁作用的機理之一。但使用柴胡疏肝散治療后，MAP-2蛋白磷酸化程度仍然低于對照組，提示影響MAP-2磷酸化的還有其他因素，值得進一步研究。

4參考文獻

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(2016-01-25收稿，2016-03-19修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Influence of Bupleurum Liver-Coursing Powder on Phosphorylatied Microtubule-Associated Protein-2 in Hippocampus of Depressive Rats

LIU Jigang1, YUAN Yang2, ZANG Yu2, LIU Hao2

(1.DepartmentofStomatology,ZunhuaPeople'sHospital,Zunha064200,Hebei,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China)

[Abstract]Objective: To observe the influence of bupleurum liver-coursing powder on phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (pMAP-2) in hippocampus of depressive rats. Methods: Forty-five male Wistar rats were randomly divided into control group, model group and treatment group. The depression animal model was produced by giving the rats chronic unpredicted mild stress and treatment group received intragastric administration of bupleurum liver-coursing powder for 22 days. The sucrose preference test, elevated plus maze test and Morris water maze test were adopted to observe behavioral changes of rats in each group. The expression of pMAP-2 protein and mRNA were detected by western blot and real-time PCR respectively. Results: Compared with control group, sucrose preference percentage of model group was significantly lower, the number of entry into open arms and percentage of detention time extended significantly, the escape latency of Morris water maze test increased significantly, and the expression of pMAP-2 protein and mRNA were decreased significantly (P<0.05). Compared with model group, sucrose preference percentage of treatment was significantly higher, the number of entry into open arms and percentage of detention time decreased significantly, the escape latency of Morris water maze test decreased significantly, and the expression of pMAP-2 protein and mRNA were increased significantly (P<0.05). Conclusion: Bupleurum liver-coursing powder has a significant anti-depressant effect, and its mechanism may be relavent to its effect on the phosphorylation of MAP-2 in hippocampus.

[Key words]bupleurum liver-coursing powder; depression; hippocampus; microtubule-associated protein; rats,wistar

[中圖分類號]R285.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0387-04

*[基金項目]國家自然科學基金(81201048)

**通信作者 E-mail:liuhao938@163.com

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1857.060.html