MTHFR基因多態性與蒙古族絕經后婦女骨質疏松的相關性研究

郭志英，栗平，羅云娜，張淑珍，武志鋒

(內蒙古醫科大學第二附屬醫院功能科，內蒙古 呼和浩特　010030)

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MTHFR基因多態性與蒙古族絕經后婦女骨質疏松的相關性研究

郭志英，栗平，羅云娜，張淑珍，武志鋒

(內蒙古醫科大學第二附屬醫院功能科，內蒙古 呼和浩特010030)

摘要：目的探討本地區蒙古族絕經后婦女亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因的多態性位點C677T、A1298C基因多態性與內蒙古地區蒙古族絕經后女性骨質疏松癥(osteoporosis，OP)遺傳易感性的關系。方法收集150 例門診及住院(確診為骨質疏松)蒙古族絕經后婦女為觀察組，對照組來自門診按年齡配比的骨含量正常的蒙古族絕經后婦女145 例，均以雙能X線骨密度儀測定腰椎和髖部骨密度，以T值≤-2.5診斷為骨質疏松，-2.5≤T≤-1.0為骨含量減少，T值>-1.0為骨含量正常，并進行MTHFR C677T及A1298C基因多態性檢測。結果骨質疏松組MTHFR基因受體C677T基因型CC、CT、TT頻率分別為29.3%、44.0%和27.7%，對照組基因型CC、CT、TT頻率分別為42.8%、44.8%和12.4%，兩組差異有統計學意義(P=0.017)。骨質疏松癥組中的T等位基因頻率為48.7%，顯著高于對照組(34.8%，P=0.005)，提示T等位基因是骨質疏松發生的危險因素(OR=1.77，95% CI=1.18～2.64，P=0.001)。與CC基因型相比，TT基因型攜帶者的骨質疏松發生風險增加至3.15倍(95% CI=1.45～6.86，P=0.004)，該作用在年齡≥60 歲及體重指數偏高的女性中表現更明顯。而MTHFR A1298C的多態性位點對絕經后骨質疏松的發生沒有顯著影響(P=0.513)。結論MTHFR C677T基因變異與蒙古族絕經后婦女骨質疏松易感性明顯相關，MTHFR A1298C的多態性位點與蒙古族絕經后婦女骨質疏松的發生沒有明顯相關性。

關鍵詞：骨質疏松癥；亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態性；絕經后婦女

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是老年女性人群中常見的一種代謝性骨病，其特點為高轉換型骨量丟失、骨吸收大于骨形成而易致骨折發生。一旦發生骨折，將會影響老年女性的生存質量，嚴重時可致殘甚至致死。因此，有關PMOP的防治研究具有非常重要的臨床價值與現實意義。PMOP作為遺傳與環境因素共同作用的一類復雜性疾病受諸多因素的影響，而基因所起的作用占70%左右[1]，如維生素D受體基因、雌激素受體基因、Ⅰ型膠原蛋白等[2-4]。新近報道的白介素-6(interleukin-6，IL-6)在日本女性人群中也與骨質疏松密切相關[5]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)基因是影響骨質疏松及骨質疏松性骨折發病的重要候選基因之一，它是葉酸代謝通路上參與DNA正常合成和甲基化的重要基因之一。本研究擬采用以婦女為基礎的病例-對照研究方法，探討MTHFR基因的功能性SNPs位點(C677T和A1298C)與我國內蒙古地區蒙古族婦女絕經后骨質疏松易感性的關系，進一步闡明絕經后骨質疏松癥的可能分子機制，為骨質疏松癥的防治提供理論基礎和新的線索。

1資料與方法

1.1對象入選病例要求為55～75 歲門診及住院骨質疏松女性患者，蒙古族聚居區三代純蒙古族，年齡方面保持均衡，具有可比性。排除有影響骨代謝的疾病及其他需長期治療的嚴重慢性疾病者，共有150 例患者作為觀察組納入調查。對照組為來自門診體檢的同條件女性蒙古族人群，均由專業人員采用雙能X線骨密度儀對研究對象進行腰椎及雙側股骨近端股骨頸骨密度測定，以T值≤-2.5診斷為骨質疏松，-2.5≤T≤-1.0為骨含量減少，T值>-1.0為骨含量正常。

1.2方法每個樣本對象抽取5 mL靜脈血，分裝于EDTA抗凝管中，用于提取基因組DNA，收集好的抗凝血貯存于-80℃冰箱備用。本研究的標本收集均經本醫院倫理委員會認可并獲得患者知情同意。采用OMEGA D3392全血DNA小量提取試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)提取DNA，按常規蛋白酶K、酚/氯仿法提取，然后由聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析技術檢測295 例樣本C677T、A1298C基因型分布情況。C677T引物序列如下：上游引物：5′GGGGTCAGAAGCATATCAGT-3′；下游引物：5′-CTCACCTGGATGGGAAAGA-3′。A1298C引物序列如下：上游引物：5′GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3′；下游引物：5′-TCTCCCGAGAGGTAAAGAACAAA-3′。擴增參數：50℃預熱2 min，95℃預變性10 min，然后95℃變性15 s，62℃復性1 min，共40個循環，400V恒溫電壓、2%瓊脂糖膠電泳，電泳15 min后取膠。擴增后用紫外線凝膠圖像分析系統分析并保存，最后在熒光定量PCR儀(7700型，ABI公司)上檢測熒光信號。

酶切反應總體積15 μL，包括10 μL PCR擴增產物，1 μL TapⅠ(1U)內切酶，2 μL的10×Buffer TapⅠ，2 μL的H2O。65℃水浴過夜，400 V恒溫電壓、2%瓊脂糖膠電泳，電泳15 min后取膠，應用凝膠成像儀判斷酶切結果。

1.3統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。根據Hardy-Weinberg定律，比較各組基因型和等位基因頻率的實際數與預期數，了解各基因型在人群中遺傳平衡符合程度。兩組之間的基因和等位基因頻率差異進行卡方檢驗，并計算比值比。

2結果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗對照組145 例中，兩種基因型在對照組中的分布規律均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(見表1～2)。

表1　Hardy-Weinberg平衡檢驗

表2　研究對象基本資料±s)

2.2骨質疏松組和對照組MTHFR中兩個多態性位點基因型比較對照組MTHFR C677T基因型頻率：CC 42.8%、CT44.8%和TT 12.4%，而骨質疏松組的基因型頻率：CC9.3%、CT 44.0%和TT 27.7%。骨質疏松組和對照組CC、CT、TT種基因型分布頻率的差異有統計學意義(χ2=8.155，P=0.017)。骨質疏松組中C、T等位基因頻率為51.3%、48.7%，對照組為65.2%、34.8%，骨質疏松組和對照組的C、T等位基因頻率分布差異有統計學意義(χ2=7.920，P=0.005)。T的骨質疏松發生風險是C的1.77倍(95% CI=1.18～2.64，P=0.001)。與CC純合子比較，TT純合子的骨折風險增加至3.15倍(95% CI=1.45～6.86，P=0.004)。

MTHFR A1298C的3種基因型頻率在骨質疏松組中分別為：AA 62.7%、AC 20.0%和CC 17.3%，而對照組基因型分布為AA 66.2%、CC 22.1%和CC 11.7%。A1298C基因型多態性位點和骨質疏松易感性無明顯相關(χ2=1.335，P=0.513)。詳細資料見表3。

表3　病例組和對照組中MTHFR兩個多態性位點基因型比較

3討論

骨質疏松是一種普通的代謝性骨病，是眾所周知的“沉默病”，往往沒有癥狀，直到髖部受到輕微創傷發生骨折才被人們所關注，該病已成為全球重要的公共衛生問題之一[11]。其特征為骨量下降、骨骼脆性增加和骨組織微觀結構破壞，最終引起骨折發生率增加。骨質疏松性骨折是老年人群殘疾和間接死亡的最主要原因，嚴重影響老年人晚年生活質量。本研究旨在研究MTHFR基因多態性位點C677T、A1298C基因多態性與內蒙古地區蒙古族絕經后女性骨質疏松癥遺傳易感性的關系，發現C677T基因變異與內蒙古地區蒙古族絕經后女性骨質疏松癥易感性明顯相關。如果能從基因方向找到老年骨質疏松癥的根本性原因，將對骨質疏松癥的預防和治療產生積極影響。

近年來遺傳因素對骨質疏松及骨質疏松性骨折發病率的影響逐步受到重視。亞甲基四氫葉酸還原酶基因是影響骨質疏松及骨質疏松性骨折發病的重要候選基因之一，它是葉酸代謝通路上參與DNA正常合成和甲基化的重要基因之一。MTHFR是一種黃素依賴蛋白，定位于染色體lp36.3，作為同型半胱氨酸代謝再甲基化途徑中的關鍵酶，同型半胱氨酸是含硫醇的氨基酸，形成于蛋氨酸代謝中。MTHFR普遍存在于人、動物及其他原核、真核生物體內，哺乳類動物以肝臟分布最多，能將5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-亞甲基四氫葉酸，為同型半胱氨酸轉變為蛋氨酸參加代謝提供甲基，此環節受阻可導致同型半胱氨酸在體內蓄積。有研究還發現，MTHFR的基因C677T純合子突變型TT基因型患者血中同型半胱氨酸濃度高于野生型基因型(CC型)。近年來澳大利亞的Wong等[7]對老年人半胱氨酸水平的研究支持這一結果。而CT基因型血同型半胱氨酸濃度介于兩者之間，從而引起一系列病理生理過程[8-9]，繼而與多種疾病的發生(如復發性流產、腦卒中、冠心病及神經管畸形等等)產生一定關聯[10-13]。有一些研究報道認為，該基因多態性與骨質疏松性骨折或低BMD風險增加有關。然而，也有研究未能確證這種關聯。例如，近來在墨西哥人群的基因檢測證實了MTHFR C677T與骨質疏松的遺傳易感性[14]。相反，Golbahar等發現該基因多態性與伊朗女性股骨頸或腰椎BMD沒有關聯。我國香港人群的研究結果也顯示，MTHFR C677T與骨質疏松性骨折發病風險無關[15]。這些研究結果的差異可能部分由于研究人群的不同，如種族、年齡、環境和遺傳修飾。

本研究從分子流行病學角度探討了MTHFR基因的2個多態性位點(A677T和A1298C)與絕經后婦女骨質疏松發病風險之間的關系。而在以上相關研究中，A1298C多態性位點與疾病的關系并不密切。近年來對于MTHFR的研究日益廣泛，我國僅有該基因與江蘇地區絕經后女性的相關性報道，其他地區鮮見。本次研究的主要目的在于找出該基因與老年人骨質疏松的關系，以期達到及早預防和治療的目的，最大幅度降低老年人晚年因骨質疏松乃至骨折帶來的對個人、家庭及社會的重大負擔。

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Association of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) Polymorphism with Osteoporosis in Mongolian Postmenopausal Women

Guo Zhiying，Li Ping，Luo Yunna，etal

(The Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010030，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)gene C677T、A1298C polymorphisms and osteoporosis in Mongolian postmenopausal women.MethodsOne hundred and fifty postmenopausal female patients with osteoporosiswere enrolled.one hundred and forty-five contrasts were healthy Mongolian postmenopausal women outpatients matched with age to conduct a case-control study.Bone mineral density (BMD) at lumbar spine，femoral neck，trochanter and Ward′s triangle were measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA).The T value is less than or equal to -2.5 for the diagnosis of osteoporosis；-2.5≤T≤-1.0 for bone decreased；the T≥-1.0 content of normal bone.and MTHFR gene polymorphism measurement were performed to all subjects.ResultsThe frequencies of MTHFR C677T Genotype CC、CT and TT in osteoprosis group were 29.3%，44.0% and 27.7%，respectively，in the contrasts group.The frequencies of MTHFR were 42.8%、44.8% and 12.4%.the difference between groups was statistically significant (P=0.017).The frequencies of T allelic genes was 48.7% in osteoporosis group，evidently higer than that in contrast group (34.8%，P=0.005).T was the risk factor of osteoporosis (OR=1.77，95% CI=1.18～2.64，P=0.001).Comparing to the CC，TT genotype carriers loose osteoporosis risk increases to 3.15 times (95% CI=1.45～6.86，P=0.004).On the otherside，Polymorphism of MTHFR A 1298C on the occurrence of postmenopausal osteoporosis had no significant effect (P=0.513).The effect was more obvious in 60 years of age or elder and high BMI in women.ConclusionThe MTHFR C677T polymorphism may contribute to the susceptibility of osteoporosis in Mongolian postmenopausal women.

Key words：osteoporosis；methylene tetrahydrofolate reductase；genic polymorphism；postmenopausal women

作者簡介：郭志英(1979- )，女，主治醫師，內蒙古醫科大學第二附屬醫院功能科，010030。

收稿日期：2015-08-25

中圖分類號：R322.7+1

文獻標識碼：A

基金項目：內蒙古醫科大學第二附屬醫院院級科研項目(2013YJJ29)