醫用臭氧對肝癌細胞HepG2生物學行為的實驗研究*

周玉川　劉康　鐘立明　楊巧麗　游箭　魏欣　鄧川

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院　1.組織工程與干細胞研究所；2.介入放射科， 四川 南充 637000)

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·論著·

醫用臭氧對肝癌細胞HepG2生物學行為的實驗研究*

周玉川1劉康1鐘立明2楊巧麗2游箭2魏欣2鄧川2

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院1.組織工程與干細胞研究所；2.介入放射科， 四川 南充 637000)

【摘要】目的探討使用醫用臭氧(O3)在體外對肝癌HepG2細胞的作用。 方法獲取人肝癌HepG2細胞在體外增殖、傳代、對數生長期的細胞，將細胞分為對照組和實驗組，實驗組采用含濃度為0.5μg/ml的醫用臭氧水的培養液處理細胞，對比兩組試驗的細胞形態學變化，細胞生長曲線、細胞凋亡情況、細胞遷移能力變化。結果體外實驗結果顯示，含臭氧的培養基中細胞數量明顯減少，腫瘤細胞膜破裂，核固縮甚至裂解，臭氧對細胞的生長有抑制作用，同時CCK-8的檢測結果顯示O3能抑制肝癌細胞的增殖(P<0.01)，Transwell遷移實驗顯示O3能抑制腫瘤細胞的遷移(P<0.01)。結論臭氧能直接殺死肝癌HepG2細胞，能在體外抑制肝癌HepG2細胞的增殖和遷移。

【關鍵詞】臭氧；肝癌HepG2細胞；抑制作用；殺傷

肝癌是全球惡性程度極高、預后極差的惡性腫瘤之一。肝癌的發生發展是一個涉及多基因、多步驟的復雜的過程[1]，傳統治療肝癌的手段主要有手術治療、放療和化療等，隨著基礎醫學和生命科學的不斷發展，人類對惡性腫瘤的生物學特性及其治療方式研究的不斷深入，聯合運用多種綜合治療方式已被大多數學者所接受。近年來，對于臭氧(O3)是否能夠治療惡性腫瘤仍存在懷疑，關于O3的療效報道不一[2]。國內外有關單獨應用O3治療惡性腫瘤的報道極少，O3發揮腫瘤治療作用的機制尚不清楚。本研究擬采用一定的醫用O3濃度作用于體外培養的肝癌HepG2細胞，觀察其對肝癌細胞的生物學影響，探討O3應用于臨床治療腫瘤的可行性，同時為O3治療惡性腫瘤的體外實驗提供可行的實驗方案，為后續的研究提供重要的研究方法和數據。

1材料和方法

1.1材料和主要試劑人肝癌細胞株HepG2購自ATCC；O3由南充市中心醫院介入科臭氧發生儀(Medozon，德國赫爾曼)制得；CCK-8檢測試劑盒購自日本DOJINDO公司；細胞培養板、Matrigel基質膠和基質膜購自BD公司；CO2培養箱、離心機購自Thermo Fisher公司；酶標儀購自上海科華公司；電子熒光顯微鏡購自日本NIKON；DMEM高糖培養基(HyClone, Thermo scientific)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養人肝癌HepG2細胞快速復蘇后，接種于T75的培養瓶中，加10ml含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養基，混勻后置于37℃的5%CO2培養箱中。

1.2.2細胞形態觀察取對數生長期的細胞，向48孔板中加入5×104個/孔的細胞，分為實驗組和對照組，實驗組加入含臭氧0.5μg/ml的10%胎牛血清的培養液500μl，對照組加入等量的含血清培養基。24h后倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，瑞氏染液染色，拍照。

1.2.3細胞生長曲線測定將1個48孔板分成實驗組和對照組，實驗組加入含臭氧0.5μg/ml培養液600μl，對照組加入等量的含血清培養液，繼續培養7天，每天取3孔用牛鮑氏計數板計數，取每日均數作圖，即為細胞生長曲線。

1.2.4CCK-8檢測O3對肝癌細胞的抑制作用取對數生長期的細胞，經0.25% 胰酶消化后制成6×105個/ml的細胞懸液。向48孔培養板中加入100μl/孔細胞混懸液。將細胞分為2組，分別是濃度為0.5μg/ml的O3實驗組和未處理的空白對照組，復孔數為5。待細胞貼壁后，吸出培養液，實驗組中添加含臭氧0.5μg/ml的含血清培養液500μl，空白對照組添加含血清培養液500μl。各組細胞處理24 h 后每孔加入10μl CCK-8，37℃孵育4h。4h后，吸取上清液200μl于96孔板中，在波長450nm處測吸光度值并記錄。

1.2.5Transwell遷移實驗將對數生長期HepG2細胞 分為空白對照組和實驗組，空白對照組加含血清培養液預處理8h，實驗組用含O30.5μg/ml的含血清培養液預處理8h，然后換為無血清培養基饑餓處理4h后消化細胞，每組分別設3個復孔，每個培養小室上室內加入200μl細胞懸液(5×104個細胞)。培養小室下加入600μl 含10%FBS的DMEM高糖培養液，培養24 h。將膜用PBS洗2次 ，用棉簽輕輕擦拭上室內側面的細胞，用福爾馬林液固定30 min，洗2次，0.1%結晶紫染色，室溫30min，然后用PBS液清洗3次，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野觀察，計數每個視野的細胞數，取平均數。

1.3統計學分析運用t檢驗對肝癌細胞增殖和遷移的結果進行統計學分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1腫瘤細胞的形態學觀察腫瘤細胞貼壁生長，在培養24h后細胞生長狀況(如圖1)，可以看到對照組細胞生長良好，形態正常，染色結果顯示細胞結構完整，胞漿豐富，核均勻分布。而O3組細胞數量明顯少于對照組，細胞邊緣模糊，胞漿減少，細胞膜破裂，核固縮甚至裂解。

圖1對照組(a,b,c)和實驗組(d,e,f)腫瘤細胞形態學對比

Fig1Morphology of control group and experiment group

注：b,c,e,f采用瑞氏染色；a,c,d,f(×200);b,e(×100)

2.2腫瘤細胞的生長曲線空白對照組種植在48孔板中第1天，細胞生長緩慢，第1～4天細胞呈對數生長，第4～6天細胞處于穩定狀態，第6～7天細胞出現衰老死亡。實驗組細胞在培養的第1天細胞總數顯著減少，第2～5天細胞緩慢生長，第5～6天出現較快生長，第6～7天趨于穩定，見圖2。

2.3O3對肝癌細胞增殖的影響在細胞培養24 h 后采用CCK-8檢測各孔的吸光度值，以空白組做對照，測得各組 OD 值(見圖3)，運用T檢驗對實驗組與對照組做分析，結果表明O3對肝癌細胞的增值有抑制作用，結果有顯著統計學意義(P<0.01) 。

圖2實驗組和對照組細胞生長曲線

Figure 2The growth curve of experiment group and control group

2.4Transwell遷移實驗實驗結果顯示，經臭氧處理的實驗組HepG2細胞穿過聚碳酸脂膜的細胞數量明顯低于空白對照組(見圖4)，經T檢驗計算差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

圖3臭氧對HepG2 細胞增殖的影響.

Figure 3The effect of ozone solution on proliferation of liver cancer cell HepG2

注： 與對照組比較，①P<0.01

圖4對照組(a)與實驗組(b)O3對HepG2 細胞遷移的影響

Figure 4The effect of ozone solution on migration of liver cancer cell HepG2

注：結晶紫染色(×200)；兩組比較P<0.01

3討論

O3水具有極強的氧化性，是廣譜的殺菌劑。但臭氧的化學性質極不穩定，在空氣和水中會分解變成氧氣和氧自由基，O3變成氧氣的解離速度取決于溫度，pH值，水質[3]。本次實驗采用的醫用臭氧水都是在按臨床治療標準配置而成，雙蒸水高壓滅菌后，測得pH值為7.0，在20℃制得含臭氧0.5μg/ml的培養液。從制得的臭氧濃度的培養基到加樣完成控制在20min以內，操作過程中減少避免劇烈震蕩，盡量減少實驗前O3的消耗，并在無菌室溫環境下培養10min，充分保證O3與培養細胞的反應時間和濃度，然后放入37℃的CO2培養箱中繼續培養。

據Bhalla D.K[4]研究，臭氧能損傷人體的呼吸道黏膜，甚至能導致肺部炎癥，此外無報道對人體其他組織有影響，實驗人員在操作過程中盡量減少與臭氧的直接接觸，帶好口罩，手套，在安全柜中進行實驗。

有大量報道O3用于各種疾病的治療，主要利用O3的強氧化性、抗炎、鎮痛以及殺菌的作用[5～9]。最新報道[10]稱臭氧還能用于緩解肌肉疲勞，改善心功能。自從利用O3的自血療法[11]治療腫瘤并取得療效后，已有相關研究報道其在體內抗腫瘤的作用機制，如增強紅細胞的代謝，改善局部血液循環，增強免疫系統，誘導產生大量的免疫細胞因子[12]。有報道體外O3對腫瘤細胞有抑制作用[13]，但O3對腫瘤細胞的體外抑制作用機制尚不明確。就本實驗來說，還沒有任何O3在體外單獨抑制肝癌HepG2細胞增殖的報道。

Huz JI等[14]的報道低氧環境能促進腫瘤細胞的生長，其機理是O3在水溶液中能逐漸分解產生氧氣，造成一個持續的富氧環境，抑制腫瘤組織和細胞的生長。Sweet等[15]將人工培養的肺癌、乳腺癌及子宮癌細胞暴露在空氣中，并且分別施加不同濃度的O3于密閉的空氣中，觀察不同濃度的O3對腫瘤細胞及正常組織細胞的影響，當O3濃度達到0.3～0.5μg/m1能抑制40-60%腫瘤細胞的生長，而非腫瘤細胞并沒有明顯損傷；當空氣中的O3濃度達0.8μg/m1，90%的腫瘤細胞增長受到抑制，非腫瘤細胞的損傷達到50%，該實驗結果顯示O3濃度控制在一定范圍內可以選擇性殺滅腫瘤細胞。而本次實驗的濃度為0.5μg/m1，正是基于該報道，事實證明，在該濃度下，腫瘤細胞的增殖抑制作用明顯，與上述報道相符。還有研究[16]顯示O3與化療藥物聯合使用能提高5-Fu療效。

癌細胞最主要的生物學特征是能持續的分裂和增殖，因此抑制腫瘤細胞的分裂增殖，甚至能誘導其凋亡是腫瘤治療的重要手段之一[17]。本次實驗選用形態學觀察、生長曲線、CCK-8 法和Transwell遷移實驗對O3的增殖抑制作用進行檢測，獲得了O3抑制肝癌細胞增殖的體外實驗證據。首先通過形態學觀察，發現腫瘤細胞膜通透性增強，導致胞漿漏出，進而胞膜褶皺，呈毛細胞樣，最后出現裸核。而細胞核的變化跟細胞凋亡一樣，先是核固縮，最后細胞核裂解[18]。這與Kuroda K1[19]的動物實驗結果相同，與臭氧直接接觸的腫瘤細胞都發生了壞死，但這與Costanzo[20]的研究結論不同，可能與實驗方法有關。特別是兩者之間的濃度差異和處理方式不同有關。因此，臭氧是否能激發細胞凋亡的通路還是因為理化性質導致腫瘤細胞裂解還不得而知，這需要后續的實驗去研究。

實驗繪制的生長曲線和CCK-8檢測細胞增殖中，實驗組的細胞因為部分被直接殺死，部分細胞形態受到影響，因此生長曲線檢測細胞培養過程出現最初的細胞數量減少，然而隨著培養時間延長，O3被分解，變成O2不溶于水而揮發，對細胞的作用減少甚至消失，一段時間后腫瘤細胞呈現增長。在Transwell遷移實驗中，因細胞死亡和結構的變化，實驗組穿過聚碳酸脂膜的細胞數量較空白對照組顯著減少。

4結論

本實驗顯示，醫用臭氧水在體外條件下能夠直接強力殺傷腫瘤細胞，破壞細胞結構，但作用機制尚待深入研究。提示臭氧有望更多的用于腫瘤患者的康復與治療。后續研究將觀察臭氧對肝癌家兔體內的療效。并從形態學入手，逐步探索臭氧治療腫瘤的機理。

【參考文獻】

[1]牛靜靜. siRNA靶向沉默fbxl20基因對肝癌SMMC-7721細胞生物學行為的影響[J].川北醫學院學報, 2012, 27(3): 221-224.

[2]Clavo B，Ceballos D，etal. Long-term control of refractory hemorrhagic radiation proctitis with ozone therapy [J]. J Pain Symptom Manage, 2013,46(1):106-112.

[3]何華名, 栗亞飛. 不同制備方式臭氧水溶解規律及噴霧特性研究[J]. 沈陽農業大學學報, 2013, 44(5): 678-682.

[4]Bhalla DK. Ozone-induced lung inflammation and mucosal barrier disruption: Toxicology, mechanisms, and implications[J]. Toxicol. Environ. Health. B Crit. Rev,1999,2:31-86.

[5]何曉峰. 臭氧治療醫學的創新、發展與前景[J]. 西部醫學, 2010, 22(12): 2187-2190.

[6]谷玉玲．醫用臭氧自血療法聯合中醫康復治療老年缺血性腦卒中的臨床觀察[J]．內蒙古中醫藥, 2012, 31(16): 17-18.

[7]楊圣偉.淺談醫用臭氧的臨床應用及前景展望 [J]. 臨床醫藥實踐雜志, 2008,4.

[8]Sagai M, Bocci V. Mechanisms of Action Involved in Ozone Therapy: Is healing induced via a mild oxidative stress[J]. Medical Gas Research, 2011,1:29.

[9]Clavo B, Santana-Rodriguez N, Llontop P,etal.Ozone Therapy in the Management of Persistent Radiation-Induced Rectal Bleeding in Prostate Cancer Patients[J].EvidBased Complement Alternat Med,2015,480369.

[10] Di Filippo C, Trotta MC, Maisto R,etal.Daily Oxygen/O3Treatment Reduces Muscular Fatigue and Improves Cardiac Performance in Rats Subjected to Prolonged High Intensity Physical Exercise[J].Oxid Med Cell Longev, 2015, 2015:190640.

[11] Martínez-Sánchez G, Delgado-Roche L,etal. Effects of ozone therapy on haemostatic and oxidative stress index in coronary artery disease[J]. Eur J Pharmacol, 2012，15;691(1-3):156-162.

[12] 郭雪嬌. 醫用臭氧治療膝骨性關節炎的機制及臨床研究進展[D]．山東：山東大學，2013.

[13] 韓世龍，朱曉黎.經皮注射醫用臭氧治療兔VX2移植瘤的實驗研究[J].Journal of Interventional Radiology, 2013, 22(3):223-227.

[14] Huz JI. Spontaneous regression of hepatocellular carcinoma is most often associated with tumour hypoxia or a systemic inflammatory response[J]. HPB (Oxford), 2012,14(8):500-505.

[15] Sweet F，Kao MS，Lee SC，etal．Ozone selectively inhibits growth of human cancer cells[J].Science, 1980，209：931-933.

[16] Z?nker KS, Kroczek R.In vitro synergistic activity of 5-fluorouracil with low-dose ozone against a chemoresistant tumor cell line and fresh human tumor cells[J].Chemotherapy, 1990,36(2):147-154.

[17] 王琪琳．靶向c-FLIP在癌癥治療中的分子調節機制[J]．Chinese journal of immunology,2013, 29(9) 998-1002.

[18] 湯雪明.醫學細胞生物學[M].北京：科學出版社，2004.

[19] Kuroda K, Azuma K, Mori T,etal.The Safety and Anti-Tumor Effects of Ozonated Water in Vivo[J].Int J Mol Sci, 2015, 22,16(10):25108-25120.

[20] Costanzo M, Cisterna B, Vella A,etal. 2015 Apr 21. Low ozone concentrations stimulate cytoskeletal organization, mitochondrial activity and nuclear transcription[J]. European Journal of Histochemistry,2015,59:2.

Research for the treatment of medical ozone on liver cancer cell line HepG2

ZHOU Yuchuan1,LIU Kang1,ZHONG Liming2,et al

(1.ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCells·TheSecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China；2.DepartmentofInterventionalMedicinc,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the inhibitory effect of medical ozone on liver cancer cell line HepG2 in vitro. MethodsThe liver cancer cell line HepG2 were divided into experiment group and control group. The experiment group was treated with 0.5μg/ml medical ozone. The morphology, growth curve, apoptosis and migration ability were observed. ResultsThe cells in experiment group were decreased compared with that of control group. There were cell membrane breakage, karyopycnosis and even nuclear cracked in experiment group. Transwell model Assay showed tumor cells migration was inhibited by ozone solution. ConclusionOzone can restrain proliferation and migration of liver cancer cell line HepG2, and can directly kill HepG2 liver cancer cells in vitro.

【Key words】Ozone; Liver cancer cell line HepG2; Inhibition; Kill

(收稿日期：2015-11-02； 編輯： 陳舟貴)

【中圖分類號】R 735.7

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.006

通訊作者：鐘立明，主任醫師，教授，電話：13696235751

基金項目：南充市應用技術研究與開發項目(13A0047)